外用聯(lián)合靶向siRNA治療生殖器皰疹豚鼠模型實驗

李淑林　韓建德　廖綺曼　李　歡　李茵茵　李紅梅　馬春光　陳木開

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·論著·

外用聯(lián)合靶向siRNA治療生殖器皰疹豚鼠模型實驗

李淑林1，2韓建德1廖綺曼1李歡1李茵茵3李紅梅3馬春光1陳木開1

目的：評價聯(lián)合靶向特異性小干擾RNA(HSV-2 UL27.2 和UL29.2 基因)對生殖器皰疹(GH)模型的療效。方法：(1)病毒攻擊實驗：雌性豚鼠60只，隨機分為治療組和對照組，每組30只，治療組小鼠外陰和陰道內外用聯(lián)合靶向特異性小干擾RNA(CT-siRNA)，對照組外用非靶向基因的RNA制劑(siN.C)，作用4小時后接種皰疹病毒2型(HSV-2)野生株，觀察豚鼠發(fā)病情況并計算生存率。(2)選取接種HSV-2后具有初發(fā)GH反應的雌性豚鼠60只，分為治療組和對照組，每組30只，分別外用CT-siRNA和siN.C制劑，每周1次至皮損愈合。2個月后小鼠腹腔內注射環(huán)磷酰胺并給予紫外線照射誘導復發(fā)，計算皰疹復發(fā)率。結果：病毒攻擊感染后治療組存活率(80.0%)高于對照組(23.3%)(P<0.05)。治療第10天治療組皮損積分值(0.25±0.25)較對照組明顯降低(1.0±1.25)(P<0.05)。誘導復發(fā)后，治療組復發(fā)率(16.7%)低于對照組(60.0%)(P<0.05)。結論：外用CT-siRNA制劑能預防HSV-2的感染及復發(fā)。

小干擾RNA；生殖器皰疹；動物模型

生殖器皰疹(GH)是由單純皰疹病毒(HSV-2)感染引起的最常見的性傳播生殖器潰瘍性疾病。20 世紀80年代研制出的核苷類似物標志著抗皰疹病毒藥物新時代的開始,此類藥物到目前為止仍是臨床首選的藥物，但是目前的抗病毒藥物不能有效阻止GH感染，完全抑制和清除潛伏的HSV病毒。研究開發(fā)新的藥物一直是臨床關注的熱點。體外合成的小分子dsRNA，被稱為小干擾RNA(siRNA)，能直接觸發(fā)RNA干擾(RNAi)，從而高效率、特異性抑制目的基因[1]。RNAi技術抗病毒具有高效、特異、操作簡單等特點，為HSV預防和治療提供了新的途徑。多篇關于用特異siRNA抑制病毒包括HSV復制增殖的文章已被發(fā)表[2-4]。我們有關外用聯(lián)合靶向特異性siRNA制劑(CT-siRNA：聯(lián)合靶向HSV-2 UL27.2和UL29.2基因，分別編碼包膜糖蛋白gB和一個DNA黏合蛋白)的體外抗病毒研究已證實其能明顯的抑制HSV復制增殖[5,6]。我們在此基礎上，結合GH 臨床的發(fā)病特點，建立GH動物模型，研究聯(lián)合靶向HSV-2 UL27.2和UL29.2基因外用制劑預防HSV感染和治療GH效果，現(xiàn)報道如下。

1　材料和方法

1.1外用siRNA制劑制備

1.1.1siRNA設計與合成根據GenBank中獲取HSV-2 gB和DNA黏合蛋白基因mRNA序列(GenBank Accession No.L09242),采用Am2bion公司和Genscript公司在線siRNA設計,以及Palliser et al.在nature雜志發(fā)表的論文，得到2對18～19個堿基的siRNA：UL27.2(編碼一個包膜糖蛋白gB nt 54370-54388),sense5’-ACGUGAUCGUGCAGAACUC-3’, antisense5’-GAGUUCUGCACGAUCACGU-3’;UL29.2(一個DNA黏合蛋白nt6032-60342)，sense5’-CUUUCGCAAUCAAUUCCAA-3’,antisense5’-UUGGAAUUGAUUGCGAAAG-3’;另設隨機的不靶向任何基因的對照組(siN.C)作為陰性對照：sense5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’, antisense5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’上述序列提交上海吉瑪公司合成。

1.1.2把特異靶向UL27.2和UL29.2 siRNA干粉分別用DEPC2H2O溶解后,得到濃度為20 μmol/L的siRNA溶液,與脂質體Lipofectamine 2000(Invitrogen)均勻混合[5]。siN.C用同樣方法。外用CT-siRNA霜劑參考Takanashi等的方法，油相：白凡士林、硬脂酸、液體石蠟水溶70℃；水相：羥苯乙酯、甘油、三乙醇胺、吐溫-80、氮酮、蒸餾水加熱保溫80℃；將水相緩緩加入油相，至乳化，至室溫時加入siRNA，制成外用combined targeting siRNA(CT-siRNA)制劑(濃度為500 pmol/0.1 mL siRNA)。

1.2病毒和實驗動物HSV-2野生株來源于中山大學附屬第一醫(yī)院皮膚性病科門診生殖器皰疹患者水皰皰液分離培養(yǎng)，用免疫熒光方法和RT-PCR方法分型鑒定為HSV-2 D型，并進行擴增。實驗動物為干凈級Hartley豚鼠，雌性，重量約(250±20)g，合格證號:0084315 0092328和許可證號：SYXK(粵)2009-0023。

1.3實驗方法

1.3.1病毒接種方法實驗豚鼠先用生理鹽水清洗豚鼠外陰，再用粗糙的細玻璃棒摩擦陰道黏膜數(shù)次，繼之用1 mL注射器吸取0.1 mL含HSV-2野生株，病毒液配上灌胃針頭伸入豚鼠陰道內3 cm將病毒液注入陰道穹隆處后緩慢退出，最后用灌胃針頭輕柔外陰局部2～3 min，待無病毒液溢出時再將豚鼠放回籠子。隨機取10只初發(fā)GH皮損作病理檢查，誘導復發(fā)豚鼠取脊神經根電鏡觀察。

1.3.2病毒攻擊實驗實驗豚鼠隨機分為兩組，外用CT-siRNA治療組30只和對照組(外用siN.C)30只，分別于外陰陰道內涂藥后4 h，陰道內接種HSV-2野生株2×104p.f.u.，(接種方法同上)觀察外陰局部反應和全身反應、死亡率、陰道分泌物HSV-2培養(yǎng)結果。整理數(shù)據，并行統(tǒng)計分析。

1.3.3治療GH試驗實驗豚鼠先用生理鹽水清洗豚鼠外陰，陰道內接種103p.f.u HSV-2野生株，取有初發(fā)GH的實驗豚鼠60只，隨機分為2組各30 只，分別予陰道內和外陰外用特異CT-siRNA(500 pmol )制劑或外用不靶向任何基因的siN.C制劑治療，每天觀察治療后豚鼠局部發(fā)病的癥狀和排病毒情況。對每只豚鼠外陰皮損進行積分計算，積分方法參考文獻[7]。皮疹愈合后每周1次給予外用制劑，治療2個月。2個月后(3天內不用外用制劑)給予環(huán)磷酰胺注射液(濃度25 mg/mL),按1 mL/kg注射。觀察1周后開始局部40 W紫外線照射豚鼠外陰,5～8 min/次，每天1次，共5次。照射后觀察記錄2周內各組豚鼠GH復發(fā)情況，并分別在第1、2周時取陰道分泌物作HSV-2培養(yǎng)。

2　結果

2.1豚鼠GH模型建立

2.1.1豚鼠受HSV-2野生株感染3天后，出現(xiàn)典型GH發(fā)生包括：外陰紅斑水腫，水皰，繼而糜爛潰瘍。見圖1a、b、c。

2.1.2豚鼠感染HSV-2野生株，觀察出現(xiàn)生殖道皰疹后表皮組織病理表皮內出現(xiàn)水皰，細胞的氣球變性及網狀變性所致細胞內水腫，周圍可見多核巨細胞及核內嗜酸性包涵體。真皮乳頭水腫，可見血管外紅細胞，真皮內程度不等的炎癥細胞浸潤，有嗜中性白細胞、淋巴細胞等(圖2a)。脊神經根電鏡觀察：髓質髓鞘變性、膜走向亂、模糊；可見球狀的病毒樣顆粒，直徑約134～220 nm，部分顆粒可見有囊膜包囊(圖2b)。提示：建立豚鼠生殖器皰疹感染模型成功，可用于外用CT-siRNA治療研究。

1a:接種病毒前;1b:接種病毒3天后出現(xiàn)紅斑、水皰;1c:5天后出現(xiàn)破潰、滲液

2a:表皮內水皰，細胞內水腫，周圍可見多核巨細胞及核內嗜酸性包涵體。真皮乳頭水腫，可見血管外紅細胞，真皮內炎細胞浸潤，有嗜中性粒細胞、淋巴細胞等(HE,×400);2b:脊神經根電鏡圖像(×40K)

圖2豚鼠生殖器皰疹感染模型組織病理和脊神經根電鏡改變

2.2豚鼠外用CT-siRNA預防HSV-2感染實驗

2.2.1HSV-2野生株感染攻擊后，兩組受病毒攻擊后豚鼠出現(xiàn)的損害嚴重程度不同，按損害嚴重程度分級參考文獻[8]，分為0級無癥狀和皮疹；I級：紅斑和丘疹；II級：水腫水皰；III級：糜爛和滲液；IV級：后肢體麻痹、癱瘓；V級死亡。兩組受病毒攻擊后出現(xiàn)的損害嚴重程度統(tǒng)計結果如下，兩組不同時間存活率比較見圖3。3、5、7天治療與對照組癥狀比較t=-5.37(P<0.001)；t=-8.25(P<0.001)；t=-5.56(P<0.01)。

損害嚴重程度癥狀等級規(guī)模及評分：0 級藍色；I級棕紅色；II級黃色；III級淺藍色；IV級紫色；V級紅色

圖3外用CT-siRNA和對照siN.C制劑后，給予皰疹病毒2型(HSV-2)野生株攻擊結果

2.2.2外用CT-siRNA和對照兩組HSV-2感染后豚鼠存活率比較病毒攻擊8天，CT-siRNA 組存活率80%，對照組存活率23.3%，兩組對比，χ2=17.844，P<0.001(圖4)。

圖4外用CT-siRNA和對照siN.C制劑后，給予病毒攻擊后不同時間存活率比較

2.3外用CT-siRNA治療豚鼠GH實驗

2.3.1外用CT-siRNA治療組和對照組豚鼠初發(fā)GH皮損積分值比較見表1。

表1　外用CT-siRNA治療組和對照組

注：t為治療3、5、7、10天治療組與對照組比較，P<0.001

2.3.2GH豚鼠治療組和對照組GH復發(fā)情況見表2。

表2　GH豚鼠治療組和對照組復發(fā)率

注：治療組與對照組兩組復發(fā)率比較χ12=11.92(P<0.05)，治療組與對照組病毒培養(yǎng)陽性率比較χ22=17.78(P<0.05。

3　討論

GH是一種由HSV感染引起的常見的性傳播疾病。GH除了可以引起患者生殖器的水皰潰瘍反復發(fā)作，還可引起播散性HSV感染、病毒性腦膜炎、盆腔炎等一系列并發(fā)癥，孕婦GH可引起胎兒感染和新生兒皰疹，GH還可以增加HIV 感染的危險性。估計全球每年有2300萬新發(fā)HSV-2感染者[9]。多數(shù)GH是由HSV-2引起。傳統(tǒng)的抗病毒藥物常通過對病毒編碼的DNA多聚酶選擇性磷酸化而起作用，在病毒潛伏階段這些基因并不大量表達，故對于潛伏感染的病毒無作用，不能阻止GH的下次復發(fā)和無癥狀排病毒，國內外學者近年來對治療GH進行了很多探索，包括疫苗研究和免疫佐劑治療[10]，未獲得滿意收獲。

RNA干擾技術抑制病毒的繁殖和感染是當前抗病毒研究領域的一個熱點[11]。Palliser等在2006年的nature雜志發(fā)表的論文提供了一種簡單、高價效的外用siRNA 抗病毒制劑，把標記熒光素的特異siRNA與陽離子脂質混合陰道內投放，在實驗中觀察到其可以被陰道和子宮頸黏膜上皮細胞、固有層和間質細胞攝取，對預防和治療GH 有明顯效果。有學者認為這是目前最接近臨床應用可能的一種抗病毒外用siRNA 制劑。

豚鼠受HSV-2野生株感染生殖道后，出現(xiàn)典型GH發(fā)病，包括：外陰紅斑水腫，水皰，繼而糜爛潰瘍；觀察出現(xiàn)生殖道皰疹典型表皮組織病理改變。脊神經根電鏡觀察可見髓質髓鞘變性，球狀的病毒樣顆粒。提示建立豚鼠生殖器皰疹感染模型成功，可用于外用CT-siRNA治療研究。

我們選取靶向HSV-2 UL27.2和UL29.2基因(分別編碼包膜糖蛋白gB和一個DNA黏合蛋白)的聯(lián)合，制備了聯(lián)合靶向特異性siRNA制劑。我們先前體外抗病毒研究已證實這種聯(lián)合特異性siRNA制劑能明顯的抑制HSV復制增殖。雌性豚鼠隨機分組給予外陰和陰道內外用CT-siRNA制劑和不靶向任何基因對照RNA(siN.C)制劑后，陰道內給予皰疹病毒2型(HSV-2)野生株攻擊，實驗結果顯示，對照組豚鼠易受病毒感染，發(fā)病迅速且癥狀重，并發(fā)癥亦嚴重，部分出現(xiàn)單側或雙側后肢壞死癱瘓后死亡。而外用CT-siRNA制劑組豚鼠癥狀明顯輕微，存活率顯著高于對照組，提示CT-siRNA制劑能特異性干擾抑制目的基因，起到預防和抗HSV-2的感染的作用。

另外建立豚鼠生殖器皰疹感染，觀察出現(xiàn)生殖道皰疹后，隨機分為治療組和對照組，分別給予CT-siRNA和siN.C外用制劑治療，觀察發(fā)病情況，皰疹皮損變化情況和愈合時間，治療組皮損改善快和愈合時間縮短(P<0.05)。 提示CT-siRNA能特異性抑制病毒HSV-2復制，控制GH病情和促進愈合。愈合后外用制劑繼續(xù)治療每周1次,1個月后兩組均給予環(huán)磷酰胺注射液腹腔注射和紫外線燈局部照射誘導復發(fā),CT-siRNA制劑治療組復發(fā)率要低于對照組(P<0.05)，陰道分泌物的病毒培養(yǎng)陽性率低于對照組(P<0.05)，提示定期使用外用CT-siRNA制劑能抑制病毒HSV-2復制，減少GH的無癥狀排毒和復發(fā)。

實驗表明外用CT-siRNA制劑能防治HSV-2的感染、早期治療可以控制縮短GH的病程，每周1次外用可控制或減少GH復發(fā)、無明顯不良反應。與傳統(tǒng)治療比較，此方法應用簡單、有可能在控制GH 的反復發(fā)作和間歇性排毒這些方面取得突破。

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(收稿：2015-07-20修回：2015-10-05)

Effect of topical combined targeting siRNA on guinea pig with genital herpes

LIShulin1,2,HANJiande1,LIAOQiman1,LIHuan1,LIYinyin3,LIHongmei3,MAChunguang1,CHENMukai1.

1.DepartmentofDermatology,FirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510080，China; 2.DepartmentofDermatology,ShenzhenZhongshanUropoiesisSurgicalHospital,Shenzhen518000,China;3.StateKeyLaboratoryofSunYat-senUniversityPestManagement,Guangzhou510275,China

CHENMukai,E-mail:ytchen2008@gmail.com

Objective: To assess the effect of combined targeting siRNA (CT-siRNA, HSV-2 UL27.2 gene combined UL29.2 gene) on genital herpes of guinea pig. Methods: (1) HSV-2 infection experiment: sixty guinea pigs were divided into the treatment group and control group (30 in each group). Guinea pigs in the treatment group were treated with topical CT-siRNA on vulva and vagina and those in the control group were treated with siN.C. After 4 hours, the herpes virus type 2 (HSV-2) wild strains were inoculated to vagina in all the guinea pigs. (2) Sixty guinea pig models with the infection of genital herpes were divided into the treatment group and control group (30 guinea pigs in each group). Guinea pigs in the treatment group were treated with topical CT-siRNA on vagina and those in the control group were treated with siN.C, once a week until lesion healing. All guinea pigs were treated with intraperitoneal injections of cyclophosphamide and ultraviolet radiation to induce the recurrence after the 2 month treatment and the recurrence rate was assessed. Results: The survival rate in the treatment group was 80%, which was higher than that in the control group (23.3%), (P<0.05). At day 10 of the treatment, the lesions score in the treatment group was (0.25±0.25), which was lower than that in the control group (1.0±1.25) (P<0.05). The recurrence rate in the treatment group was 16.7%, which was lower than that in the control group (60%), (P<0.05). Conclusion: Topical CT-siRNA can reduce the infection rate and recurrence of HSV-2.

siRNA; genital herpes; animal model

廣東省科技計劃項目(編號：2008B03030144)

1中山大學附屬第一醫(yī)院皮膚科，廣州，510080

2深圳中山泌尿外科醫(yī)院，深圳，518000

陳木開，E-mali:ytchen2008@gmail.com

3中山大學有害生物防治國家重點實驗室，廣州，510275