血清microRNA-17-5p在膽管癌患者中的表達及其臨床意義

郭婧瀾，譚蓓蓓，葉婷

（西南醫科大學附屬醫院1.檢驗科，2.核醫學科，四川 瀘州 646000）

血清microRNA-17-5p在膽管癌患者中的表達及其臨床意義

郭婧瀾1，譚蓓蓓2，葉婷1

（西南醫科大學附屬醫院1.檢驗科，2.核醫學科，四川 瀘州 646000）

目的探討循環microR NA-17-5p（miR-17-5p）在膽管癌患者血清中的表達，以及在膽管癌診斷和預后方面的價值。方法利用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qR T-PCR）檢測79例膽管癌患者及健康對照血清標本中miR-17-5p的表達，并利用統計學方法分析循環miR-17-5p在膽管癌中的診斷和預后價值。結果qR T-PCR發現，循環miR-17-5p在膽管癌患者血清中的表達高于健康對照組；受試者工作特征曲線顯示，循環miR-17-5p為膽管癌有效的診斷分子靶點；χ2檢驗結果表明，循環miR-17-5p與膽管癌患者的TNM分期呈正相關；卡普蘭-邁耶生存曲線顯示，循環miR-17-5p的表達水平與膽管癌患者術后5年總體生存率、無進展生存率呈負相關。結論循環miR-17-5p在膽管癌患者血清中表達水平顯著增高，是膽管癌早期診斷和判斷預后的潛在分子指標。

循環miR-17-5p；診斷；預后；膽管癌

膽管癌是起源于膽道內皮的惡性腫瘤，易發生早期淋巴轉移和遠處轉移。膽管癌的發病率近年來呈逐年上升趨勢，且其發病機制和易感因素尚未完全清楚[1]。根治性手術是目前唯一可能治愈膽管癌的治療方法[2]。由于膽管癌缺少早期癥狀，當典型臨床表現出現時，多數患者已處于進展期，而無法進行根治性手術[3-4]。另外，由于缺少高度敏感性和特異性的膽管癌早期診斷指標，膽管癌患者預后極差，通常只有幾個月，多數因腫瘤發生轉移而死亡[5]。在臨床上通常使用糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）作為膽管癌診斷和判斷預后的分子指標，但其敏感性和特異性均達不到理想水平，因此迫切需要尋找新的膽管癌早期診斷和判斷預后的分子指標。

microRNA（miRNA）是一類廣泛存在于真核生物體內的內源性的非編碼小分子RNA[6]。研究發現，miRNA在包括膽管癌在內的大多數腫瘤中異常表達，可作為癌基因或抑癌基因發揮重要的作用，提示miRNA在腫瘤的基礎研究和臨床應用上具有廣闊前景[7-8]。更為重要的是，腫瘤患者血清和血漿中miRNA表達譜的相關研究證實，循環miRNA可以穩定地被檢測并提示腫瘤狀態，是非常具有前景的腫瘤早期診斷和判斷預后的分子指標[9-10]。然而，目前關于膽管癌患者血清中的循環miRNA的表達和臨床價值方面的研究尚不足。本研究中，筆者檢測循環miR-17-5p在79例膽管癌患者血清中的表達，并進一步分析其在早期診斷和判斷預后方面的臨床價值。

1 材料與方法

1.1一般資料

1.1.1研究對象選取2010年12月-2014年6月于西南醫科大學附屬醫院就診的膽管癌患者79例，以及同期健康對照患者79例，共158例。其中，行根治性手術治療73例，姑息性手術治療6例。所有入選患者的臨床病理資料完整。納入標準：①膽管癌患者經病理組織學確診為膽管癌，且均為初診、初治患者；②患者入組前未接受放、化療；③入組患者無明顯肝、腎功能異常；④未合并其他器官腫瘤或嚴重內科疾病。入組患者術前術后空腹采血各5ml，于真空干燥管中保存，1 500 r/min離心10 min后置入-80℃冰箱冷凍中保存待測。本研究經西南醫科大學附屬醫院倫理委員會批準，所有入選的膽管癌患者同意使用其血清標本用于科學研究，并簽署知情同意書。

1.1.2實驗試劑和儀器miR-17-5p和內參U6引物購自北京TIANGEN科技有限公司，miRcute miRNA提取分離試劑盒購自北京TIANGEN科技有限公司，miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒購自北京TIANGEN科技有限公司，SYBR Fast qPCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。主要儀器：美國Bio-Rad CFX96熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀，中國海爾公司-80℃冰箱，中國海爾公司-20℃冰箱，德國Eppendorf公司臺式低溫高速離心機。

1.2實驗方法

1.2.1循環miR-17-5p的提取及逆轉錄循環miR-17-5p提取方法參照北京TIANGEN科技有限公司的miRcute miRNA提取分離試劑盒所述步驟。紫外分光儀檢測RNA濃度及純度。逆轉錄步驟參照北京TIANGEN科技有限公司miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒所述步驟，每個逆轉錄體系中含有10 ng RNA模板。逆轉錄條件為：16℃變性30min，42℃退火30min，85℃延伸5min。

1.2.2實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-timepolymerasechainreaction，qR T-PCR）qRT-PCR反應條件為：95℃預變性3 min，95℃變性12s，60℃退火35s，共循環40次。采用的相對定量法計算循環miR-17-5p的相對表達量，相對表達量=2-Δct，Δct=ctmiR-17-5p-ctU6，ct為每個反應管熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數。

1.2.3血清CA19-9含量檢測使用瑞士羅氏公司的Cobas e 601電化學發光分析儀及配套CA19-9檢測試劑盒，對膽管癌患者血清CA19-9進行檢測，參考值為0～34u/ml。

1.3統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，膽管癌患者與健康對照、膽管癌患者術前與術后循環miR-17-5p表達差異比較用t檢驗，循環miR-17-5p表達與膽管癌患者臨床病理特征之間的關系用χ2檢驗，循環miR-17-5p的診斷價值用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC），Kaplan-Meier法繪制生存曲線，各組間生存差異比較用Log-rankχ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1膽管癌患者血清循環miR-17-5p的表達

qRT-PCR結果顯示，循環miR-17-5p在79例膽管癌患者血清中的相對表達量為（21.971± 13.134），79例健康對照組血清中miR-17-5p的相對表達量為（0.873±0.782），經t檢驗，差異有統計學意義（t=13.763，P=0.000）。miR-17-5p在膽管癌患者血清中相對表達量高于健康對照組。見圖1。

圖1　膽管癌患者血清miR-17-5p的表達水平

2.2膽管癌患者手術前后血清循環miR-17-5p的表達

qRT-PCR結果顯示，在73例行根治性手術治療的膽管癌患者中，術前miR-17-5p的相對表達量為（20.641±12.232），術后miR-17-5p的相對表達量為（4.516±4.458），經t檢驗，差異有統計學意義（t= 10.583，P=0.007），術后循環miR-17-5p的表達較術前降低。而在6例行姑息性手術治療的膽管癌患者中，術前miR-17-5p的相對表達量為（28.572±21.603），術后miR-17-5p的相對表達量為（20.167±9.087），經t檢驗，差異無統計學意義（t=0.879，P=0.403），手術前后血清循環miR-17-5p的表達水平無明顯改變。見圖2。

圖2　膽管癌患者手術前后血清miR-17-5p的表達變化

2.3循環miR-17-5p表達水平對膽管癌的診斷效率

根據79例膽管癌患者術前循環miR-17-5p和CA19-9的表達水平繪制ROC曲線，結果顯示，miR-17-5P的ROC曲線下面積為0.855[95%置信區間（Confidenceinterval，CI）：0.795，0.915]，敏感性為81.051%，特異性為75.947%，對應診斷界值7.27，CA19-9的ROC曲線下面積為0.814（95%CI：0.747，0.880），敏感性為75.941%，特異性為71.931%。提示在膽管癌中循環miR-17-5p有較高的診斷價值。見圖3。

圖3　循環miR-17-5p和CA19-9對膽管癌的診斷價值

2.4循環miR-17-5p的表達與膽管癌患者臨床病理特征的關系

miR-17-5p高表達的TNMⅠ、Ⅱ期膽管癌患者14例，miR-17-5p高表達的TNMⅢ、Ⅳ期膽管癌患者28例；miR-17-5p低表達的TNMⅠ、Ⅱ期膽管癌患者26例，miR-17-5p低表達的TNMⅢ、Ⅳ期膽管癌患者11例，經χ2檢驗，差異有統計學意義，循環miR-17-5p的表達上調與膽管癌患者的TNM分期相關，隨著膽管癌TNM分期進展，循環miR-17-5p的表達亦逐漸升高。而循環miR-17-5p的表達與患者的年齡、性別、細胞核分化程度等臨床病理特征無關。見附表。

2.5循環miR-17-5p與膽管癌患者術后5年生存率的關系

根據73例行根治性切除術的膽管癌患者術前循環miR-17-5p表達水平，將膽管癌患者分為循環miR-17-5p高表達組和循環miR-17-5p低表達組。卡普蘭-邁耶生存曲線顯示，循環miR-17-5p高表達組的膽管癌患者的術后5年總體生存率和無進展生存率均低于循環miR-17-5p低表達組（總體生存率log-rank test：P=0.012，無進展生存率log-rank test：P=0.023）。見圖4。

附表　臨床病理因素與膽管癌患者循環miR-17-5p表達水平的關系例

圖4　循環miR-17-5p與膽管癌患者術后5年生存率的關系

3 討論

既往文獻顯示，循環血液中的miR-17-5p可作為多種腫瘤的診斷和判斷預后指標，包括肺癌、胃癌、胰腺癌和肝癌等[11-15]。筆者發現，膽管癌患者血清循環miR-17-5p為膽管癌早期診斷和判斷預后的重要指標。本研究中，筆者檢測循環miR-17-5p在膽管癌和健康對照血清中的表達水平，研究發現，循環miR-17-5p在膽管癌患者血清中表達較健康對照升高。而后筆者利用ROC曲線評估循環miR-17-5p作為膽管癌診斷指標的可行性，結果顯示，根據膽管癌患者血清中循環miR-17-5p的表達水平可有效地區分出膽管癌患者，是膽管癌有效的診斷指標。另外，研究發現循環miR-17-5p與膽管癌患者TNM分期及術后5年總體和無進展生存率密切相關，結果顯示，循環miR-17-5p的水平隨著TNM分期升高而相應升高，循環miR-17-5p高表達的膽管癌患者術后5年總體生存率和無進展生存率均低于循環miR-17-5p低表達組，提示在膽管癌中，miR-17-5p可能起到癌基因的作用。

miR-17-5p是miR-17-92家族成員，在多種腫瘤中發揮癌基因的作用。miR-17-5p在多種腫瘤中表達異常升高，包括結腸癌、胃癌、肝細胞癌、和腦膠質瘤等[16-19]。另外，研究發現miR-17-5p在乳腺癌、肺癌及結腸癌中可調控腫瘤細胞的增殖和分化[20-22]。更為重要的是研究發現，miR-17-5p可抑制p21、BIM、AIB1和E2F1等抑癌基因的表達而促進腫瘤細胞增殖和分化[20，23-24]。在膽管癌的發生、發展中，miR-17-5p同樣發揮著重要作用。研究顯示，過表達miR-17-5p可上調YES1的表達，而進一步促進膽管癌細胞的增殖并抑制腫瘤細胞凋亡[25]。筆者認為，miR-17-5p在膽管癌的發生、發展中同樣起到癌基因的作用。

綜上所述，筆者的研究證實，膽管癌患者血清中miR-17-5p表達高于健康對照組；血清中miR-17-5p膽管癌早期診斷為有效的分子指標；膽管癌患者循環miR-17-5p的水平與膽管癌的TNM分期分呈正相關，而與年齡、腫瘤類型及分化程度等臨床病理特征無關；血清中miR-17-5p高表達的膽管癌患者5年總體生存率和無進展生存率均低于循環miR-17-5p低表達組。本研究揭示循環miR-17-5p在膽管癌中的臨床價值，為膽管癌的早期診斷及預后判斷提供潛在分子靶點。

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（童穎丹編輯）

Expression of circulating miR-17-5p in cholangiocarcinoma patients and its clinical significance

Jing-lan Guo1，Bei-bei Tan2，Ting Ye1
（1.Clinical Laboratory；2.Department of Nuclear Medicine，the Affiliated Hospital of Southwest Medical University，Luzhou，Sichuan 646000，China）

Objective To explore the expression of circulating miR-17-5p in the patients with cholangiocarcinoma and its clinical significance.Methods Expression of circulating miR-17-5p was analyzed by qRTPCR in 79 patients with cholangiocarcinoma.Statistical analysis was conducted to analyze the diagnostic and prognostic value of circulating miR-17-5p in cholangiocarcinoma.Results qRT-PCR revealed that the circulating miR-17-5p was significantly up-regulated in the serum of the patients with cholangiocarcinoma compared to the normal controls.ROC curves revealed that circulating miR-17-5p was a promising diagnostic biomarker for patients with cholangiocarcinoma.Chi-square test revealed that circulating miR-17-5p was positively associated with clinical stage of the patients with cholangiocarcinoma.Kaplan-Meier curves revealed that the cholangiocarcinoma patients with high circulating miR-17-5p expression had poorer outcome compared to the patients with low circulating miR-17-5p expression.Conclusions Circulating miR-17-5p expression is up-regulated in serum of patients with cholangiocarcinoma，and is a promising diagnostic and prognostic biomarker for patients with cholangiocarcinoma.

circulating miR-17-5p；diagnosis；prognosis；cholangiocarcinoma

R 735

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.19.009

1005-8982（2016）19-0042-05

2016-07-06