根霉脂肪酶選擇性水解紅花油富集亞油酸

甘爭艷 ，付青存，賈殿贈

(1.新疆輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830021；2.新疆大學(xué)研究生院,新疆 烏魯木齊 830046)

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精細(xì)化工與催化

根霉脂肪酶選擇性水解紅花油富集亞油酸

甘爭艷1*，付青存1，賈殿贈2

(1.新疆輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830021；2.新疆大學(xué)研究生院,新疆 烏魯木齊 830046)

通過實驗探討溫度對根霉脂肪酶選擇性水解紅花油的影響，并進行條件優(yōu)化。在pH=6.0的K2HPO4/KH2PO4緩沖溶液中,水解溫度30 ℃、根霉脂肪酶用量為紅花油質(zhì)量的2%、水油質(zhì)量比為1和添加劑CaCl2用量為紅花油質(zhì)量的0.2%條件下，紅花油水解率為66.5%，可富集濃度96.2%的亞油酸。

精細(xì)化學(xué)工程；根霉脂肪酶；富集；亞油酸

亞油酸是含有兩個雙鍵的多不飽和高級脂肪酸，工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛；亞油酸能降低血液膽固醇，預(yù)防動脈粥樣硬化，在醫(yī)療中得到重視[1]。亞油酸不能由人體合成，是公認(rèn)的惟一的必需脂肪酸[2]，其在紅花油中含量遠(yuǎn)高于其他植物。常規(guī)富集亞油酸是將紅花油經(jīng)皂化和酸化后，再用尿素包合，進行蒸餾獲得亞油酸，這種方法容易造成亞油酸雙鍵破壞。與皂化法相比，脂肪酶可在常溫下催化紅花油水解，從而避免對亞油酸中雙鍵的破壞。在緩沖溶液中用酶催化油脂水解，避免了有機溶劑的毒性，且后期分離比較容易[3]。根霉脂肪酶Lipase F-AP15水解油脂時，優(yōu)先水解α位的酯鍵，而紅花油中亞油酸酯鍵大多位于α位，在控制合適水解率時，可以富集高濃度亞油酸。 本文探討溫度對根霉脂肪酶選擇性水解紅花油的影響，并研究水解紅花油富集亞油酸的優(yōu)化工藝條件。

1　實驗部分

1.1試劑與儀器

根霉脂肪酶Lipase F-AP15，日本天野公司，酶活力150 000 U·g-1；紅花油，伊犁，碘值146.1 mg·g-1，紅花油中亞油酸含量79.2%；氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液為0.1 mol·L-1和0.5 mol·L-1；10 g·L-1酚酞指示劑；磷酸二氫鉀；磷酸氫二鉀；石油醚；正己烷；去離子水；乙醚；氯仿。

ZD-8802型振蕩器；Orion 828型酸度計，美國奧立龍公司；高速組織搗碎機；微量注射器。

1.2水解方法及水解率的計算

在A組錐形瓶中加入紅花油，B組錐形瓶中加入按一定比例配制的酶/水(或緩沖液)溶液，預(yù)熱到水解溫度后按實驗設(shè)計將兩組溶液迅速混合，并放入振蕩器，以設(shè)定速率振蕩到預(yù)定時間后，迅速加入無水乙醇終止水解，并用氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，計算混合體系酸值。紅花油水解率通過下式計算：

式中，AVt為反應(yīng)結(jié)束時水解產(chǎn)物酸值，AV0為反應(yīng)開始時體系酸值，SV為紅花油皂化值，AV為紅花油酸值。紅花油皂化值SV可取平均值193 mg·g-1,酸值為1.5 mg·g-1。

2　結(jié)果與討論

2.1水解溫度

在根霉脂肪酶用量為紅花油質(zhì)量的2%、水油質(zhì)量比為1、pH=6.0的K2HPO4/KH2PO4緩沖溶液和振蕩器震蕩速率200 r·min-1條件下，考察水解溫度對根霉脂肪酶選擇性水解紅花油的影響，結(jié)果見圖1。

圖 1　水解溫度對紅花油水解率的影響Figure 1　Influence of hydrolysis temperatures on hydrolysis ratios of safflower oil

由圖1可見，水解時間大于60 min時，40 ℃時可獲得較大水解率。水解時間10 min時，水解率隨水解溫度上升而增加，水解溫度超過50 ℃時，水解率下降。主要是因為：(1) 隨著水解溫度升高，活化分子數(shù)增多，水解反應(yīng)速率加快；(2) 由于水解溫度升高，酶失活加速，導(dǎo)致水解速率下降。水解時間短時，酶變性失活不明顯，溫度升高導(dǎo)致的水解速率增加占優(yōu)勢，而長時間水解時，酶變性失活更為顯著[4]。水解時間1 440 min，水解溫度20 ℃，水解率為67.7%，與理論水解率66.67%接近，反應(yīng)溫度35 ℃、40 ℃和45 ℃時，水解率分別為81.4%、83.2%和80.6%，明顯超過66.67%，分析原因可能是：已部分水解的產(chǎn)物2-單甘酯和1，2-二甘酯在較高溫度下經(jīng)歷較長時間發(fā)生酯鍵重排，2位上的酯鍵重排至1、3位。酯鍵重排后，可以繼續(xù)被脂肪酶水解，導(dǎo)致水解率升高；水解溫度越高，酯鍵重排比例越大，酶催化位置選擇性下降。

水解溫度超過50 ℃，并進行較長時間水解時，水解率不升反降。分析原因：根霉脂肪酶是一種具催化活性的蛋白質(zhì)，在超過了根霉脂肪酶的最高催化溫度時，酶變性失活，水解速率下降，且溫度越高，酶失活速率越快。分析可知，在較低溫度下水解，重排反應(yīng)少,根霉脂肪酶選擇性水解率高，有利于獲取高濃度的亞油酸；但溫度過低時，水解速率過低，導(dǎo)致反應(yīng)時間過長，綜合分析以上因素，水解溫度選擇30 ℃較為合適。

2.2pH值

在根霉脂肪酶用量為紅花油質(zhì)量的2%、水油質(zhì)量比為1、水解溫度30 ℃、水解時間120 min、振蕩器震蕩速率200 r·min-1和0.05 mol·L-1的K2HPO4/KH2PO4為緩沖溶液條件下，考察緩沖溶液pH值對紅花油水解率的影響，結(jié)果見圖2。

圖 2　緩沖溶液pH值對紅花油水解率的影響Figure 2　Influence of buffer solution pH values on hydrolysis ratios of safflower oil

由圖2可見，pH=6.0時，水解率較高，表明脂肪酶在此微酸性條件下活力較高。

2.3脂肪酶用量

在水油質(zhì)量比為1、水解溫度30 ℃，pH=6.0的K2HPO4/KH2PO4緩沖溶液0.05 mol ·L-1和振蕩器震蕩速率200 r·min-1條件下,考察不同根霉脂肪酶用量時，水解時間對紅花油水解率的影響，結(jié)果見圖3。

圖 3　不同根霉脂肪酶用量時，水解時間對紅花油水解率的影響Figure 3　Influence of hydrolysis time on hydrolysis ratios of safflower oil over F-AP15 lipase with different enzyme levels

由圖3可見，水解初期，水解率隨水解時間增長較快；水解時間超過960 min，水解率隨時間延長增長速度緩慢，這是因為根霉脂肪酶催化紅花油水解時，具有位置選擇性，因此，不宜采用過長的水解時間。紅花油中的亞油酸主要位于α位，將水解率控制在理論水解率66.7%時，富集亞油酸的效果最佳。實驗結(jié)果表明，根霉脂肪酶用量為紅花油質(zhì)量的1%和水解時間960 min時，水解率為65.3%，接近理論值，水解時間1 440 min時，水解率為68.9%；根霉脂肪酶用量為紅花油質(zhì)量的2%和水解時間480 min時，水解率為66.5%，接近理論水解率。綜合考慮脂肪酶成本及水解時間，根霉脂肪酶用量為紅花油質(zhì)量的2%較合適。

2.4亞油酸的富集

所選實驗條件為：根霉脂肪酶用量為紅花油質(zhì)量的2%，水油質(zhì)量比為1，CaCl2用量為紅花油質(zhì)量

的0.2%，水解溫度30 ℃，K2HPO4/KH2PO4緩沖溶液pH=6.0，振蕩器振蕩速率200 r·min-1,水解時間480 min,此條件下，紅花油水解率為66.5%。對水解后高級脂肪酸混合物進行薄層色譜分析，亞油酸含量達(dá)96.2%。

3　結(jié)　論

(1) 采用根霉脂肪酶水解紅花油富集亞油酸，條件溫和，在根霉脂肪酶用量為紅花油質(zhì)量的2%、CaCl2用量為紅花油質(zhì)量的0.2%、水解溫度30℃和，K2HPO4/KH2PO4緩沖溶液pH=6.0條件下，水解率為66.5%，水解后可獲得含亞油酸高達(dá)96.2%的脂肪酸混合物。

(2) 該法具有操作簡單、條件溫和及產(chǎn)品質(zhì)量好等特點，為富集亞油酸提供了一種經(jīng)濟可行的方法。

[1]劉慶文.脂肪酶催化拆分四氫苯并咪唑-5-羧酸酯及其應(yīng)用研究[D].吉林：吉林大學(xué)，2011. Liu Qingwen.Study on the lipase-catalyzed resolution of tetrahydro-1H-benzoimidazole-5-carboxylate and its applications[D].Jilin:Jilin University,2011.

[2]張開平,惠明,田青,等.微生物脂肪酶的應(yīng)用領(lǐng)域及研究進展[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2012,33(1):90-94.

Zhang Kaiping,Hui Ming,Tian Qing,et al.research progress and application fields of microbial lipase[J].Journal of Henan University of Technology(Natural Science Edition),2012,33(1):90-94.

[3]I-Son Ng,Shau-Wei Tsai.Inverstigation of lipases from various carica papaya varieties for hydrolysis of olive oil and kinetic resolution of (R,S)-profern 2,2,2-trifluoroethyl thioesters[J].Process Biochemistry,2006,41(3):540-546.

[4]甘爭艷.無溶劑及微乳液體系中脂肪酶催化油脂水解反應(yīng)研究[D].烏魯木齊：新疆大學(xué),2006.Gan Zhengyan.Enzymatic oil hydrolysis in solvent-free medium and micro-emulsion medium[D].Urumqi：Xinjiang University，2006.

Selective hydrolysis of safflower oil by rhizopus lipase to enrichment of linoleic acid

GanZhengyan1*,FuQingcun1,JiaDianzeng2

(1.Xinjiang Vocational College of Light Industry,Urumqi 830021，Xinjiang，China；2.Graduate School of Xinjiang University，Urumqi 830046，Xinjiang，China)

The effects of temperature on selective hydrolysis of safflower oil by rhizopus lipase were investigated,and the conditions were optimized.The experimental results showed that the hydrolysis rate of safflower oil was 66.5% and the concentration of linoleic acid was 96.2% in the hydrolysis product under the optimum condition as follows:hydrolysis temperature 30 ℃,K2HPO4/KH2PO4buffer solution pH=6.0,enzyme dosage 2% of safflower oil mass,water/oil mass ratio 1,and additive CaCl2dosage 0.2% of safflower oil mass.

fine chemical engineering；rhizopus lipase;enrichment;linoleic acid

TQ426.97；Q55Document code: AArticle ID: 1008-1143(2016)09-0075-03

2016-06-06

甘爭艷，1971年生，女，碩士，工程師，研究方向為催化反應(yīng)。

甘爭艷。

10.3969/j.issn.1008-1143.2016.09.016

TQ426.97；Q55

A

1008-1143(2016)09-0075-03

doi:10.3969/j.issn.1008-1143.2016.09.016