木薯MeNCED3基因克隆、結(jié)構(gòu)變異及其表達分析

丁澤紅 付莉莉 鐵韋韋 顏彥 胡偉

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所，海口 571101）

木薯MeNCED3基因克隆、結(jié)構(gòu)變異及其表達分析

丁澤紅 付莉莉 鐵韋韋 顏彥 胡偉

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所，海口 571101）

旨在揭示木薯MeNCED3基因在干旱等非生物脅迫應答中的作用。用RT-PCR的方法從木薯葉片中克隆MeNCED3基因，用MEGA軟件構(gòu)建進化樹；用DnaSP軟件分析基因結(jié)構(gòu)變異，用熒光定量PCR技術(shù)分析MeNCED3在不同非生物脅迫下的表達特性。結(jié)果顯示，從木薯中克隆了一個NCED基因MeNCED3，該基因具有1 803 bp的開放閱讀框，編碼600個氨基酸，含有NCED家族保守結(jié)構(gòu)域。進化樹分析表明，MeNCED3與楊樹和杞柳中同源基因的親緣關(guān)系較近，序列相似性分別達到83.9%和82.5%。基因結(jié)構(gòu)變異發(fā)現(xiàn)，木薯野生種和栽培種之間共有8個錯義突變，其中5個可能與MeNCED3的表達量有關(guān)。實時熒光定量PCR分析表明，MeNCED3在根中的表達量要遠遠高于葉片和莖。而且，MeNCED3的表達能被PEG、ABA和NaCl處理顯著誘導。因此，MeNCED3在轉(zhuǎn)錄水平對木薯滲透脅迫、鹽脅迫起調(diào)控作用，可作為候選基因進一步研究其在木薯抗旱中的功能。

木薯；MeNCED3；克隆；結(jié)構(gòu)變異；表達分析

DOI：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.10.018

木薯（Manihot esculenta Crantz）是重要的糧食和經(jīng)濟作物。同大多數(shù)作物一樣，干旱脅迫嚴重地影響木薯的生長和發(fā)育，如生長緩慢、光合作用下降等，最終導致木薯塊根產(chǎn)量減少［1］。前人研究表明，脫落酸（ABA）生物合成及信號轉(zhuǎn)導可能是調(diào)控木薯耐旱性的關(guān)鍵途徑之一［1］。9-順-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED）是ABA生物合成的關(guān)鍵酶，在木薯中克隆NCED相關(guān)基因，探討它們在木薯抗旱的分子作用機制具有重要意義。

ABA是一種重要的植物激素，在種子萌發(fā)、成熟與休眠、果實成熟以及植物對逆境脅迫的響應等方面起著重要作用［2，3］。在干旱條件下，ABA被大量積累，這種累積是以ABA合成酶基因的調(diào)控為基礎［3］。NCED是高等植物ABA 生物合成途徑中的限速酶，其表達量的變化與ABA含量有著直接關(guān)系。NCED基因最早從玉米突變體中被克隆［4］，隨后在擬南芥［5］、番茄［6］、大豆［7］、水稻［8］和煙草［9］等植物中被克隆。對不同植物的NCED基因分析表明，這類基因由多個成員組成，在植物中普遍存在且序列高度保守，無內(nèi)含子。基于全基因組分析，Tan等［5］最早從擬南芥中鑒定出了5個NCED成員，并檢測了它們在擬南芥轉(zhuǎn)化植株中的表達情況，結(jié)果表明，AtNCED2和AtNCED3在擬南芥根中大量表達，主要調(diào)控側(cè)根的萌發(fā)和生長；AtNCED3、AtNCED5、AtNCED6和AtNCED9在發(fā)育的種子中表達，調(diào)控種子胚胎成熟和休眠。此外，AtNCED3在葉中的表達受干旱脅迫誘導，積累大量的ABA以響應水分脅迫。

NCED參與植物干旱等非生物逆境脅迫，是響應脅迫的重要候選基因，目前木薯中與其相關(guān)的分子作用機制尚不清楚。本研究從木薯中克隆一個NCED基因成員，MeNCED3，分析其在木薯野生種和栽培種之間的結(jié)構(gòu)變異，研究其在聚乙二醇（PEG）、脫落酸（ABA）和鹽（NaCl）脅迫處理下的表達水平，旨在為進一步研究MeNCED3的功能并解析其在木薯抗旱中的分子機理提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料

本試驗所用材料木薯栽培品種（M. esculenta cv.）Ku50和Arg7及野生種（M. esculenta ssp. Flabellifolia）W14，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所提供。

1.2方法

1.2.1材料種植與處理 在木薯種植季節(jié)（2013年5月），將Ku50粗細均勻的種莖切成長度大約15 cm至少含3-4個芽眼的莖段，種植于充滿基質(zhì)（營養(yǎng)土與蛭石以1∶1的體積比混合）的塑料盆（高18.8cm，上直徑18.5 cm，下直徑14.8 cm）里，木薯種植10 d后進行間苗。種植60 d后，選取長勢一致的植株用20%的PEG 6000溶液模擬干旱脅迫，以不施PEG（澆灌自來水）為對照。在處理0、3和24 h后，分別收集木薯葉片（包括未展開葉、第一片完全展開葉和老葉）和根的樣本，液氮冷凍、-80℃保存待用。

此外，對種植60 d的木薯采用100 μmol/L ABA進行葉片噴施處理，0、2、6、10、24、48和72 h后取樣；用200 mmol/L NaCl對木薯進行灌根處理，0 h、2 h、6 h、3 d、14 d、18 d和24 d后取樣。所取樣品液氮冷凍、-80℃保存待用。

為考察木薯野生種W14和不同栽培種Ku50和Arg7中MeNCED3基因的表達情況，收集正常大田種植環(huán)境下木薯葉片（90 d）、莖（90 d）和儲藏根（150 d）的樣本，用于qRT-PCR分析。

1.2.2RNA提取及cDNA合成 按照RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取木薯總RNA，之后用 Revert Aid First Strand cDNA Synthesis試劑盒（Fermentas 公司）將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3引物合成及qRT-PCR 用Primer6.0軟件設計引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，包括actin基因（L1：5'-TGATGAGTCTGGTCCATCCA-3'；R1：5'-CCTCCTACGACCCAATCTCA-3'）［10］，MeNCED3基因qRT-PCR引物（L2：5'-TGGGATGGTTCATGCTGTCC-3'；R2：5'-TATCCCAGAGTGGCCATGGA-3'），和MeNCED3基因全長擴增引物（L3：5'-TCTCTCCCCCAATCAAACACC-3'；R3：5'-ACCCAGAAACAGGGTGATGC-3'）。qRT-PCR按照 SYBR Green Ⅰ試劑盒（TaKaRa公司）說明操作，反應體系在Mx 3005P熒光定量PCR儀（Stratagene，美國）上進行。每個樣品3次生物學重復，表達量按照2-ΔΔCt進行計算［11］。

1.2.4生物信息學分析 用BLASTP搜索Phytozome數(shù)據(jù)庫，獲取其他物種與MeNCED3同源性較高的序列；用ClustalX進行序列比對；用CDD數(shù)據(jù)庫（Http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）進行保守結(jié)構(gòu)域分析；用MEGA5.2軟件構(gòu)建進化樹；用DnaSPv5進行SNP分析及ka/ks計算；用PlantCARE進行啟動子元件分析；用ExPASy ProtParam軟件分析蛋白質(zhì)的分子量和等電點。木薯栽培種Ku50和木薯野生種W14中MeNCED3基因序列由全基因組測序確定［12］；栽培種AM560中MeNCED3序列從Phytozome數(shù)據(jù)庫下載。

2　結(jié)果

2.1MeNCED3基因克隆

以擬南芥AtNCED3序列（AT3G14440）為基礎，在木薯數(shù)據(jù)庫尋找與其同源的序列（Manes.03-G083500.1），設計引物進行PCR擴增（圖1）。測序后得到一個全長為1 965 bp的MeNCED3序列，其中包括54 bp的5' UTR，1 803 bp的開放閱讀框，108 bp的3'UTR。該基因編碼600個氨基酸，與Phytozome數(shù)據(jù)庫木薯基因組（栽培品種：AM506）的注釋信息一致。經(jīng)與基因組信息比對，MeNCED3基因僅有1個外顯子。預測的蛋白質(zhì)分子量為 66 351.2 Da，理論等電點（pI）為6.32。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析顯示，MeNCED3編碼的蛋白含有NCED家族保守結(jié)構(gòu)域（PLN02258，圖2），進一步證實克隆到的基因為NCED3。

2.2MeNCED3基因進化樹分析

經(jīng)序列比對，獲得了與MeNCED3同源性較高的其他物種序列。進化樹分析結(jié)果（表3）表明，NCED3基因可以聚類為3組：第I組以C4物種為代表，包括玉米、谷子、狗尾草、高粱、二穗短柄草和柳枝稷，有趣的是，作為C3植物的水稻也聚類到了這一組，可能是它與二穗短柄草親緣關(guān)系較近；第II組包括擬南芥和白菜型油菜；木薯MeNCED3被聚類到第III組，它與楊樹（Potri.001G393800.1）和杞柳（SapurV1A.0617s0010.1）的親緣關(guān)系較近，序列相似性分別達到83.9%和82.5%。

圖1　MeNCED3基因全長cDNA電泳圖

圖2　MeNCED3編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析

2.3MeNCED3基因結(jié)構(gòu)分析

為了揭示MeNCED3在基因組結(jié)構(gòu)上的變異，本研究將AM560（來自Phytozome木薯數(shù)據(jù)庫）、Ku50和W14這3個材料中MeNCED3的DNA序列進行比對分析，共發(fā)現(xiàn)23個SNP，其中有8個為非同義突變（圖4）。

序列兩兩比較表明，MeNCED3的結(jié)構(gòu)變異主要來自于栽培種與野生種之間的差異，共有23個SNP；栽培種與栽培種之間的差異很小，僅有3個SNP。栽培種與野生種ka/ks值介于0.14-0.22之間，暗示MeNCED3基因在進化過程中受到了純化選擇。2.4 MeNCED3基因啟動子元件分析

啟動子是基因的重要組成部分，它與基因的表達（轉(zhuǎn)錄）息息相關(guān)。本研究選取MeNCED3起始密碼子上游1 500 bp進行啟動子元件分析，發(fā)現(xiàn)了與干旱相關(guān)的元件，如MBS。此外，還發(fā)現(xiàn)了一些與激素相關(guān)的元件，如赤霉素相關(guān)元件GARE-motif、水楊酸相關(guān)元件TCA-element和茉莉酸相關(guān)元件TGACG-motif，以及與光相關(guān)的元件，如Sp1、Box I和G-box等。這些結(jié)果表明，除了干旱，MeNCED3可能還參與激素和光相關(guān)的基因調(diào)控網(wǎng)絡。

圖3　木薯MeNCED3基因與其他物種NCED3基因系統(tǒng)進化樹

圖4　MeNCED3基因結(jié)構(gòu)變異

2.5MeNCED3基因表達分析

通過分析MeNCED3基因在木薯野生種和栽培種不同組織的表達情況，結(jié)果（圖5-A）表明，不管是野生種還是栽培種，MeNCED3在根中的表達量都要遠遠高于葉片和莖，呈現(xiàn)出根特異性表達的特點。另外，與野生種W14相比，MeNCED3在栽培種Ku50和Arg7根中的表達量上升9-10倍，而葉片和莖中則變化較小。

在PEG 6000脅迫條件下，木薯栽培種Ku50不同組織中MeNCED3基因表達的動態(tài)變化如圖5-B所示，MeNCED3在根中能被PEG處理快速誘導，其表達量在脅迫3 h和24 h后分別增加了2.5和12倍。相比之下，MeNCED3在未展開葉、第一片完全展開葉和老葉中的表達量則幾乎沒有變化，而且在第一片完全展開葉和老葉中表達量極低。這些結(jié)果進一步表明MeNCED3基因主要在木薯根中起作用。

本研究分析MeNCED3基因分別在ABA和NaCl處理下木薯Ku50葉片中表達量的動態(tài)變化（圖5-C）：在ABA處理2-6 h后，MeNCED3的表達量顯著上升，在10-48 h其表達量有所下降，隨后在72 h其表達量達到最高；與ABA處理類似，在NaCl處理2 h、6 h和3 d后MeNCED3的表達量顯著升高，在14 d其表達量有所降低，在24 d達到最高表達水平（圖5-D）。這些結(jié)果充分表明，ABA和NaCl處理能夠顯著提高MeNCED3基因的表達水平。

3　討論

NCED是高等植物ABA 生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，在植物干旱等逆境脅迫中扮演著重要角色。目前已經(jīng)從多個物種中克隆了NCED基因，然而在熱帶作物木薯中還沒有關(guān)于NCED基因克隆的報道。本研究從木薯中克隆了一個NCED基因MeNCED3。該基因具有1 803 bp的開放閱讀框，編碼600個氨基酸，含有NCED家族保守結(jié)構(gòu)域，這與前人在其他物種中的報道比較一致［8，9］；同源性分析表明，它與楊樹和杞柳的NCED3基因同源性較高。

圖5　MeNCED3基因表達分析

基因結(jié)構(gòu)變異可以引起其表達量的改變。前人通過比較測序發(fā)現(xiàn)，擬南芥中AtNCED3第274位和第327位氨基酸的變異可能引起AtNCED3表達量的改變，導致干旱條件下ABA含量的增加［13］。在本研究中，MeNCED3的表達量在木薯野生種和栽培種之間差異很大，但栽培種內(nèi)部不明顯；木薯野生種和栽培種之間共發(fā)現(xiàn)8個SNP屬于錯義突變，而且其中3個也存在于栽培種之間，暗示另外的5個SNP可能是引起MeNCED3表達量在木薯野生種和栽培種之間差異較大的原因。

植物中有多個NCED成員，且各成員在不同組織中表達量不同，可能與它們各自不同的功能相關(guān)。如擬南芥中AtNCED2和AtNCED3主要在根中表達，負責側(cè)根的萌發(fā)和生長；AtNCED5、AtNCED6和AtNCED9在發(fā)育的種子中表達，負責種子胚胎成熟和休眠［5］；水稻中OsNCED1和OsNCED3都在葉片中表達，在水分脅迫條件下，前者被顯著抑制而后者被快速誘導［14］。本研究在木薯中鑒定的MeNCED3基因在根中特異性表達，且能被PEG處理誘導，與NCED3在其他物種中的報道［5，15］比較一致。這可能是因為在干旱條件下，根是接收水分缺乏信號（如ABA信號）最早的器官，它可以吸收更深層的地下水來應對干旱脅迫［1］。

NCED基因的表達受多種非生物脅迫的誘導。例如，干旱脅迫可以誘導NCED基因的表達和植物內(nèi)源ABA的積累，而且NCED表達量的變化與ABA含量有著直接關(guān)系［3，9］。研究表明，ABA也能夠誘導NCED3基因的表達［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，在PEG和ABA處理下MeNCED3基因的表達量均顯著上升，暗示MeNCED3參與了ABA介導的干旱脅迫。然而，是否還有其他的木薯NCED基因參與干旱脅迫尚不清楚。與前人研究相似［16，17］，我們發(fā)現(xiàn)木薯MeNCED3基因能被NaCl顯著地誘導。這些結(jié)果表明，MeNCED3參與了ABA和NaCl介導的非生物逆境脅迫應答，但具體的作用機制需要進一步研究。

4　結(jié)論

采用RT-PCR的方法從木薯Ku50葉片中克隆了一個NCED基因MeNCED3，該基因編碼600個氨基酸，含有NCED家族保守結(jié)構(gòu)域。進化樹分析表明，MeNCED3與楊樹和杞柳中同源基因的親緣關(guān)系較近。序列比對分析表明，MeNCED3在木薯野生種和栽培種之間共有8個錯義突變，其中5個可能與MeNCED3的表達量有關(guān)。實時熒光定量PCR分析表明，不管是野生種還是栽培種，MeNCED3在根中的表達量要遠遠高于葉片和莖，呈現(xiàn)根特異性表達。而且，PEG、ABA和NaCl處理能顯著誘導MeNCED3的表達。

［1］Okogbenin E， Setter TL， Ferguson M， et al. Phenotypic approaches to drought in cassava：review［J］. Front Physiol， 2013， 4：93.

［2］Rodrigo M-J， Alquezar B， Zacarías L. Cloning and characterization of two 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase genes， differentially regulated during fruit maturation and under stress conditions， from orange（Citrus sinensis L. Osbeck）［J］. Journal of Experimental Botany，2006， 57（3）：633-643.

［3］Endo A， Sawada Y， Takahashi H， et al. Drought induction of Arabidopsis 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase occurs in vascular parenchyma cells［J］. Plant Physiol， 2008， 4：1984-1993.

［4］Schwartz SH， Tan BC， Gage DA， et al. Specific oxidative cleavage of carotenoids by VP14 of maize［J］. Science， 1997， 276（5320）：1872-1874.

［5］Tan BC， Joseph LM， Deng WT， et al. Molecular characterization of the Arabidopsis 9-cis epoxycarotenoid dioxygenase gene family［J］. The Plant Journal， 2003， 35（1）：44-56.

［6］Burbidge A， Grieve TM， Jackson A， et al. Characterization of the ABA-deficient tomato mutantnotabilisand its relationship with maizeVp14［J］. The Plant Journal， 1999， 17（4）：427-431.

［7］Qin X， Zeevaart JA. The 9-cis-epoxycarotenoid cleavage reaction is the key regulatory step of abscisic acid biosynthesis in water-stressed bean［J］. Proc Natil Acad Sci， 1999， 96（26）：15354-15361.

［8］Vallabhaneni R， Bradbury LM， Wurtzel ET. The carotenoid dioxygenase gene family in maize， sorghum， and rice［J］. Archives of Biochemistry and Biophysics， 2010， 504（1）：104-111.

［9］牛志強， 劉國順， 師婷婷， 等. 煙草 NCED3 基因的克隆及其干旱脅迫表達分析［J］. 中國煙草學報， 2015， 21（3）：100-106.

［10］Xu J， Duan X， Yang J， et al. Enhanced reactive oxygen species scavenging by overproduction of superoxide dismutase and catalase delays postharvest physiological deterioration of cassava storage roots［J］. Plant Physiology， 2013， 161（3）：1517-1528.

［11］ 胡偉， 顏彥， 韋運謝， 等. 木薯MeASR基因克隆及表達分析［J］.生物技術(shù)通報， 2015， 31（10）：125-130.

［12］Wang W， Feng B， Xiao J， et al. Cassava genome from a wild ancestor to cultivated varieties［J］. Nature Communications，2014， 5（5）：5110.

［13］Hao GP， Zhang XH， Wang YQ， et al. Nucleotide variation in the NCED3 region of Arabidopsis thaliana and its association study with abscisic acid content under drought stress［J］. Journal of Integrative Plant Biology， 2009， 51（2）：175-183.

［14］Ye N， Zhu G， Liu Y， et al. ABA controls H2O2accumulation through the induction of OsCATB in rice leaves under water stress［J］. Plant and Cell Physiology， 2011， 52（4）：689-698.

［15］王曉慶， 張超， 王彥杰， 等. 牡丹NCED基因的克隆和表達分析［J］. 園藝學報， 2012， 39（10）：2033-2044.

［16］Barrero J， RodríGuez PL， Quesada V， et al. Both abscisic acid（ABA）-dependent and ABA-independent pathways govern the induction of NCED3， AAO3 and ABA1 in response to salt stress［J］. Plant， Cell Environ， 2006， 29（10）：2000-2008.

［17］Xiong L， Lee H， Ishitani M， et al. Regulation of osmotic stressresponsive gene expression by the LOS6/ABA1 locus in Arabidopsis［J］. J Biol Chem， 2002， 277（10）：8588-8596.

（責任編輯 李楠）

Cloning and Analysis of Structure Variation and Expression of MeNCED3 Gene in Cassava

DING Ze-hong FU Li-li TIE Wei-wei YAN Yan HU Wei
（Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agricultural Science，Haikou 571101）

To reveal the roles of MeNCED3 gene in abiotic stresses（e.g.，drought）in cassava. RT-PCR method was applied to clone MeNCED3 gene from cassava leaves，MEGA software was used to construct its phylogenetic tree，DnaSP software was used to analysis its structural variation，and quantitative RT-PCR（qRT-PCR）was used to explore its expression patterns in response to different abiotic stresses. Results showed that a NCED（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase）gene，MeNCED3，was cloned from cassava. This gene had a 1 803 bp open reading frame，encoded 600 amino acids，and contained a NCED conserved domain. Phylogenetic analysis showed that MeNCED3 had close genetic relationship with its homologs from Populus trichocarpa and Salix purpurea，and the sequence similarity was up to 83.9% and 82.5%，respectively. Genetic structural variation revealed that a total of eight mis-sense mutations were identified between wild and cultivated cassava species，of which five may be associated with the different expression levels of MeNCED3. qRT-PCR analysis revealed that MeNCED3expression was higher in roots than in leaves and stems. In addition，the expression of MeNCED3 was significantly induced by PEG，ABA and NaCl treatments. MeNCED3 played a regulatory role in both salt and osmotic stresses at the transcriptional level and it could be served as a candidate to further study its functions in drought resistance in cassava.

cassava；MeNCED3；clone；structure variation；expression analysis

2016-04-15

海南省自然科學基金項目（20163120，20153048）

丁澤紅，男，助理研究員，研究方向：植物分子生物學；E-mail：dingzehong@itbb.org.cn

胡 偉，男，副研究員，研究方向：植物分子生物學；E-mail：huwei2010916@126.com