間接頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜法對紅花香雪蘭天然花香成分的分析

劉寶峰　高豐展　房強　王麗

(東北師范大學生命科學學院，長春130024)

間接頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜法對紅花香雪蘭天然花香成分的分析

劉寶峰高豐展房強王麗*

(東北師范大學生命科學學院，長春130024)

建立了間接頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜對紅花香雪蘭天然花香成分的分析方法。首先利用氣體采樣裝置對花香成分進行固相富集，富集后的花香成分在浸提液中解析，之后利用頂空固相微萃取方法對浸提液中的花香成分進行分析。紅花香雪蘭花香中主要成分(沉香醇、松油醇、紫羅蘭酮和二氫紫羅蘭酮)定量分析優化實驗條件:Florisil(弗羅里硅土)作為吸附劑，水-甲醇混合液(9∶1，V/V)和0．6 mol/L HCl作為浸提液，萃取溫度70℃，平衡時間為25 min。實驗結果表明，沉香醇和松油醇在1～100μg/mL范圍內有良好的線性關系(R2≥0．981)，檢出限分別為0．05和0．10μg;二氫紫羅蘭酮和紫羅蘭酮在0．5～50μg/mL范圍內有良好的線性關系(R2≥0．988)，檢出限為0．02μg。

紅花香雪蘭;花香成分;間接頂空固相微萃取;氣相色譜-質譜

1　引言

花香是植物的重要特征，是植物在生長過程中通過次生代謝釋放出的低分子量化合物，按結構分為萜類、烷烴、烯烴、醇類、酯類、含羰基和羧基類物質［1，2］。這些揮發性化合物在植物與植物之間，植物與昆蟲之間起著重要的信息傳遞作用［3，4］。同時，人工培養的花卉釋放的揮發物同人類的健康有著密切聯系［5］。如薰衣草的氣味有助于睡眠［6］;康乃馨的花香能使人的情緒平穩，精神放松［7］;而夜來香則會放出對人體有害的氣味，吸入過多對健康不利［8］。

香雪蘭是世界十大名貴切花之一，因其芳香濃郁，顏色多樣，具有很高的觀賞價值［9］。在紅花香雪蘭花香成分中含有大量沉香醇，而沉香醇是現代香水工業的重要原料之一［10］。Wu等認為，空氣中較高濃度的沉香醇可阻止香煙對人體肺部的傷害［11］。隨著香雪蘭逐漸走入家庭，有必要對其釋放花香的物質及含量進行深入研究。香雪蘭花香成分提取多采用水蒸汽蒸餾法、微波萃取法、溶劑萃取法［9，12～14］，這些方法都采用冷凍樣品進行研究。但據文獻報道，當花朵脫離植物體后，次生代謝物將會停止，并伴隨著內部發酵而產生過多的醇類［15］。因此這些實驗數據不能真實反映植物花朵在正常生長狀態下所釋放的成分和含量。盡管利用動態頂空法能對花香揮發物進行準確的定性分析，但準確定量分析尚存很大困難［14］。大氣采樣儀可以對植物花香成分進行有效富集，但定量過程中通常需要溶劑的淋洗和濃縮?；ㄏ愠煞值膿]發性將不可避免地造成采集過程中揮發成分的嚴重流失，從而影響定量分析結果。頂空固相微萃取(HS-SPME)是一種將樣品富集和熱脫附相結合的技術，具有簡單、快速、無需溶劑等特點［16～18］。通過簡單的裝置就能對植物的莖、葉和花等部位的揮發成分進行快速分析［17］。然而，由于花香揮發成分的含量差異很大，利用直接頂空固相微萃取在定量分析方面還存在許多技術問題。本實驗采用無機固相吸附劑對紅花香雪蘭花香釋放物質進行富集，再將固相吸附劑置于頂空瓶中，加入適當的浸提溶劑，在超聲作用下，富集在吸附劑上的花香成分得以釋放，再采用頂空固相微萃取法對花香成分進行定性與定量分析。本方法研究了紅花香雪蘭在正常生長過程中釋放的花香成分及其釋放量的實時監控。

2　實驗部分

2．1儀器與試劑

Agilent 5975-6890N氣相色譜-質譜聯用儀(美國Agilent公司);HP-1 MS毛細管柱(30 m×250μm×0．25μm，美國Agilent公司);固相微萃取裝置和萃取光纖(PDMS 100μm，美國Sigma公司);恒溫水浴(上海森信實驗儀器有限公司);QC-5S大氣采樣儀(建湖電子儀表廠)。

沉香醇(純度＞95%，上海漢光公司);β-紫羅蘭酮(純度＞97%)，松油醇(純度＞98%)，β-二氫紫羅蘭酮(純度＞97%)，均購自美國fluka公司;C6-C20系列烷烴標準樣品(美國Sigma公司);甲醇、丙酮和正已烷(分析純，北京化工公司)。Florisil固相富集填料(沈陽迪瑪公司)。

紅花香雪蘭來自東北師范大學花窖，進行花香成分提取時轉移到實驗室。

2．2標準溶液的配制

分別準確稱取100 mg沉香醇和松油醇，50 mg二氫紫羅蘭酮和紫羅蘭酮，用甲醇溶解并定容至10mL，作為儲備液。利用此儲備液分別配制沉香醇和松油醇濃度為5，2，1，0．5和0．1mg/mL，二氫紫羅蘭酮和紫羅蘭酮濃度為2．5，1，0．5，0．25和0．05mg/mL系列標準儲備液，于-16℃密封保存備用。

2．3花香揮發物的富集

利用大氣采樣儀和固相吸附管對花香成分進行收集，見圖1。具體方法如下:將香雪蘭花小心置于玻璃罩內，固定好花莖并密封。玻璃罩上下各有一個氣孔，下面為進氣口，接硅膠干燥管;上面為出氣口，接吸附管和大氣采樣儀。啟動大氣采樣儀，控制氣體流量為1 L/min，富集30 min。吸附管中填料為200 mg Florisil，使用前在120℃烘箱中干燥4 h，之后放入干燥器中待用。在對花香揮發物的收集前，按以上方法作空白收集。分兩次對花香成分進行收集:吸附管1和吸附管2。

圖1　花香采集裝置Fig．1　Flower volatiles collecting device

卸下大氣采樣裝置，將進氣口和出氣口塞住，固相微萃取針從玻璃罩頂部密封墊直接插入玻璃罩內，對香雪蘭花香成分富集30 min。

2．4花香成分的提取和分析

2．4．1直接頂空固相微萃取法將2．3節得到的固相微萃取針直接插入GC-MS進行分析。

2．4．2固-液萃取法吸附管1用3mL正已烷-丙酮(5∶1，V/V)浸提，超聲10min，3000 r/min離心10 min，靜止，取上清液，氮吹濃縮至0．5 mL，待測。

2．4．3間接頂空固相微萃取法直接將吸附管2的填料倒入20 mL頂空瓶中，在渦旋儀上振蕩1 min，使吸附填料分散均勻。加入1mL水、甲醇和稀HCl的混合溶劑，密封，超聲10min。將超聲后的頂空瓶置于水浴中，PDMS頂空固相微萃取針插入頂空瓶中，設定好萃取時間和溫度，進行富集。富集好后收回萃取光纖，插入GC-MS進樣口進行分析?？瞻讓嶒炓蚤g接頂空固相微萃取法進行處理和分析。

2．5花香成分的解析實驗

取50 mg固相吸附劑加入頂空瓶中，用微量取樣針取10μL標準儲備液加入固相吸附劑中，渦旋混勻，備用。將吸附劑加入頂空瓶中，密封，放在加熱板上，設定不同的溫度，考察溫度對解析效率的影響。將吸附劑加入頂空瓶，再加入浸提液，考察浸提液對解析效率的影響。

2．6色譜-質譜條件

實驗過程中采用HP-1MS彈性石英毛細管柱(30 m×0．25 mm×0．25μm)，起始柱溫60℃，保持3 min;以5℃/min升溫至100℃，保持1min，再以10℃/min升溫至250℃，保持10min。載氣為高純氦氣(＞99．999%)，不分流進樣，0．3 min后開閥。進樣口溫度250℃。轉接線溫度280℃;電離方式EI;電子能量70 eV;離子源溫度230℃;四極桿溫度150℃;掃描范圍m/z20～450，采集方式為單離子掃描和全掃描相結合的模式。

2．7數據處理

將花香揮發物中所測化合物質譜圖同標準譜庫(NIST 2008)進行對比，采用正向和反向兩種匹配方式進行定性分析，要求兩種方式定性匹配度均大于880。在相同色譜條件下，利用正構烷烴(C8～C22)計算保留指數(RI)，所得結果同譜庫標準值和相應的文獻進行對比分析。采用面積歸一化法計算化合物的相對含量，利用外標法對主要化合物(沉香醇、松油醇、紫羅蘭酮和二氫紫羅蘭酮)進行定量分析。所有實驗均重復3～4次，取平均值。

表1　不同提取方法檢測到的紅花香雪蘭的主要花香成分Table 1　Floral volatiles emitted from red Freesia flower obtained by different extractingmethods

3　結果與討論

3．1提取方法對花香揮發成分的影響

表1列出了3種不同提取方法對紅花香雪蘭花香揮發成分的分析結果。間接頂空固相微萃取法表現出明顯的優越性，共測出23種花香揮發物，其中包括13種單萜類化合物、3種倍半萜類化合物、3種無規則萜類化合物、3種醛類化合物和1種芳烴類化合物，而芳烴化合物未見過報導;直接頂空固相微萃取法共檢測出17種花香揮發物，其中單萜類化合物11種、倍半萜類化合物3種、無規則萜類化合物2種、醛類化合物1種，未測出芳烴類化合物;固-液萃取法僅檢測出12種花香揮發物，明顯少于前兩種方法。在香雪蘭花香成分中，每種提取方法所得單萜和無規則萜化合物的相對含量都占據著統治地位，其它幾類(倍半萜、醛類、芳烴類)化合物的相對含量少于1%。在花香成分中，沉香醇、松油醇、二氫紫羅蘭酮和紫羅蘭酮含量超過90%，它們是花香氣味的重要組成部分［19～21］。準確分析它們的釋放量，對香水及香料的配制有重要的指導作用。同時，吸入一定濃度紫羅蘭酮對人體癌細胞的形成具有潛在的阻止作用［22］。利用色譜峰面積評判了3種提取方法對沉香醇、松油醇、二氫紫羅蘭酮和紫羅蘭酮的萃取效率。從圖2可見，利用間接頂空萃取法(ID-HS-SPME)測得的4種化合物色譜峰面積幾乎是固-液萃取法(SE)的10倍，直接頂空法(SPME)的2倍。這是由于間接頂空固相微萃取是一種將動態富集、固液浸提和靜態頂空固相微萃取相結合的方法，分別發揮了動態富集效率高，固液浸提目標物損失小和靜態頂空定量準確的優點。相比于其它兩種方法，ID-HS-SPME分析出了更多的花香揮發成分。在定量分析中，由于ID-HS-SPME和HS-SPME測得的沉香醇、松油醇、二氫紫羅蘭酮和紫羅蘭酮的峰面積過大，超出了其定量分析的線性范圍，因此不適合對4種成分進行直接定量分析。而利用ID-HS-SPME進行定量分析時，可以通過減少固相吸附劑的取樣量，有效降低色譜峰面積，使分析數據處于線性范圍之內，從而實現4種主要花香成分的準確定量分析。

圖2　不同提取方法對沉香醇、松油醇、二氫紫羅蘭酮和紫羅蘭酮色譜峰面積的影響。直接頂空固相微萃取HS-SPME;固液萃取SE;間接頂空固相微萃取ID-HS-SPMEFig．2　Comparison of peak areas of linalool，terpineol，dihydro-β-ionone and　β-ionone obtained　by different extractingmethods

3．2萃取條件的優化

3．2．1溫度對解析效率的影響Florisil是極性吸附劑，對極性的化合物沉香醇、松油醇，二氫紫羅蘭酮和紫羅蘭酮有著很強的吸附性。圖3a給出了不同解析溫度下沉香醇、松油醇，二氫紫羅蘭酮和紫羅蘭酮的解析效率。當解析溫度為100℃時，只有沉香醇和松油醇從吸附劑中解析，色譜峰面積都較小。隨著解析溫度從100℃升高到180℃，這兩種成分的色譜峰面積有所增加，但并不顯著，而紫羅蘭酮和二氫紫羅蘭酮在整個解析溫度范圍內都沒有檢出。這說明4種花香成分在吸附劑上的解析能力受溫度的影響很小。富集花香后的吸附劑在常溫下可以進行較長時間保存，可方便對紅花香雪蘭不同花期釋放揮發物進行比較分析。

3．2．2酸濃度對解析效率的影響Florisil是一種主要由SiO2和MgO構成的無機吸附劑，在水中的溶解性很小。而加入HCl會促使其部分分解，生成相應的無機鹽MgCl2。在這個過程中，即可以使吸附在Florisil上的化合物得到釋放，同時，生成的MgCl2溶解于水，進一步增大了溶液的極性。由于浸提液極性增加，降低了低極性的4種成分的溶解度，在頂空氣相中的含量上升，從而提高了分析靈敏度。HCl濃度對4種物質解析效率的影響見圖3b，當僅有水溶液時，4種成分就已經開始解析，解析效率高于溫度對其影響。隨著HCl濃度增加，色譜峰面積略有增大，當HCl濃度達到0．6mol/L時，4種成分的峰面積都達到最大值，之后基本不再變化。

3．2．3甲醇對解析效率的影響由于沉香醇、松油醇、紫羅蘭酮和二氫紫羅蘭酮在水中的溶解度均很低，因此當僅有水與它們相互作用時，很難將其從Florisil吸附劑上解脫下來。甲醇作為一種強極性有機溶劑，即可以同水互溶，又對4種化合物都有著很好的溶解性。在超聲作用下，4種化合物可以快速從吸附劑上解脫下來，溶解到甲醇中，并能很好地分散在混合浸提液中。良好的分散性是利用靜態頂空法對化合物準確定量分析的前提。同時，甲醇在PDMS固相萃取針上富集能力較弱、對實驗干擾小。考察了甲醇的添加量對解析效率的影響(圖3c)，當浸提溶劑中不加入甲醇時，4種化合物的釋放量都較低;當加入甲醇后，4種化合物從吸附劑上的釋放速度快速增加，并有著幾乎相同的釋放趨勢。當水與甲醇的體積比為9∶1時，4種化合物峰面積達到最大值，之后隨著甲醇濃度的繼續增加，各成分的峰面積都有所下降。

3．2．4溫度和時間對萃取效率的影響溫度是頂空定量分析的重要參數，萃取溫度升高，頂空氣體中樣品的濃度增加，分析靈敏度也將提高。待測組分沸點越低，對溫度就越敏感，而適當的萃取溫度，也有利于縮短萃取時間。實驗采用單因子變量法對萃取溫度進行優化，以色譜峰面積的變化對萃取效率進行判定。設定6個不同萃取溫度40℃，50℃，60℃，70℃，80℃和90℃，考察其對萃取效率的影響。從圖4a可見，溫度對4種化合物萃取效率都有很大影響。在40℃時，4種化合物的峰面積都較低;隨著溫度升高，峰面積都快速增加。同沉香醇和松油醇相比，紫羅蘭酮和二氫紫羅蘭酮在最初過程中峰面積增加速度更快，并在70℃時色譜峰面積達到最大值;然后，伴隨著溫度繼續上升，峰面積快速下降。沉香醇的最佳萃取溫度為70℃，之后隨著溫度的上升峰面積輕微下降。在70℃～90℃之間，松油醇峰面積一直在增加，但增加幅度較小。在4種化合物中，紫羅蘭酮和二氫紫羅蘭酮的揮發性最強，沉香醇次之，而松油醇揮發性最弱。因此在最初的升溫過程中，紫羅蘭酮和二氫紫羅蘭酮的峰面積增加最快。然而PDMS的萃取是一種吸附和解吸的動態過程。當70℃后，由于解吸過程占主導作用，它們在PDMS針上的富集效率下降。同紫羅蘭酮和二氫紫羅蘭酮相反，松油醇的揮發性最弱，萃取效率對溫度的依賴最大，盡管在萃取溫度高于70℃后，峰面積仍在增加，但其變化較小，可以通過合理設定萃取時間來達到萃取平衡。由于在水中添加了有機溶劑甲醇，而過高的溫度和壓力將侵蝕固相微萃取針，并有可能造成系統漏氣。綜上，將70℃設定為4種化合物的最佳萃取溫度。

圖3　沉香醇、松油醇、二氫紫羅蘭酮和紫羅蘭酮峰面積隨解析溫度(a)，鹽酸濃度(b)和甲醇含量(c)的變化Fig．3　Peak areas of linalool，terpineol，dihydro-β-ionone andβ-ionone changed with desorption temperature (a)，hydrochloric acid concentration(b)and methanol content(c)

萃取平衡時間依賴于被測組分從溶液擴散到頂空中的速度。擴散速度越快，萃取平衡時間越短。本實驗考察了5，10，15，20，25和30min內4種化合物的萃取效率。從圖4b可見，在20min時，紫羅蘭酮色譜峰面積達到最大值，之后略有下降，當時間超過25 min時，下降加速。沉香醇和二氫紫羅蘭酮都在25min時達到最佳萃取效率，但二氫紫羅蘭酮在25min后峰面積快速減少。而松油醇在整個過程中色譜峰面積一直增加，25 min之后變化不大。綜上，萃取平衡時間選取25 min。

圖4　沉香醇、松油醇、二氫紫羅蘭酮和紫羅蘭酮色譜峰面積隨提取溫度(a)和提取時間(b)的變化Fig．4　Peak areas of linalool，terpineol，dihydro-β-ionone andβ-ionone changed with extracting temperature (a)and extracting time(b)

3．3花香揮發物定量分析方法評價

3．3．1線性范圍和檢出限在優化的條件下，利用外標法分別對2．5節解析得到的沉香醇、松油醇、二氫紫羅蘭酮和紫羅蘭酮進行定量分析。結果表明，沉香醇和松油醇在1～100μg/mL范圍內呈較好的線性，沉香醇線性方程為y=266844x+389144，相關系數R2=0．997;松油醇線性方程為y=246519x+ 796299，相關系數R2=0．981;二氫紫羅蘭酮和紫羅蘭酮在添加量0．5～50μg/mL范圍內有較好的線性關系，二氫紫羅蘭酮的線性方程為y=253988x+919995，相關系數R2=0．982;紫羅蘭酮的線性方程為y=184818x+691838，相關系數R2=0．981。通過稀釋標準溶液，采用方法2．3和2．4節方法，在優化的實驗條件測定信噪比(S/N)，得出各成分的檢出限(S/N=3)分別為:沉香醇0．05μg、松油醇0．1μg、二氫紫羅蘭酮0．02μg、紫羅蘭酮0．02μg。

3．3．2方法回收率和精密度分別取10μL系列標準儲備液置于表面皿上，放于玻璃罩內揮發5 min，采用2．3和2．4節的提取方法，在優化的提取條件下進行測試。重復測試6次，回收率為79．8%～90．6%，相對標準偏差為4．4%～8．0%，具體結果見表2。

表2　加標回收率Table 2　Recovery test

3．4實際樣品的分析

采用本方法對紅花香雪蘭在4個不同花期主要揮發成分的釋放量進行了分析，結果見表3。從表3可知，4種主要花香成分在紅蕾階段就已經開始釋放，但釋放量較低。當花盛開時，沉香醇的釋放量幾乎增加了4倍，二氫紫羅蘭酮和紫羅蘭酮也增加了1倍?；ㄊ㈤_后的第一天，沉香醇的釋放量快速減少，其它3種成分釋放量盡管也有所下降，但較為緩慢。因此，對紅花香雪蘭花香成分進行提取最好選擇在花盛開期。

表3　紅花香雪蘭花的分析結果Table 3　Analytical results of Red Freesia flower

4　結論

本實驗以紅花香雪蘭為對象，采用3種方法提取花香中的揮發性成分。結果表明，間接頂空固相微萃取法對花香成分的提取效率更高。Florisil作為吸附劑可以有效富集紅花香雪蘭花香揮發物。富集在吸附劑上的花香物質在添加了少量甲醇和HCl的提取溶液中可以得到快速釋放，靜態頂空固相微萃取結合色譜-質譜法對釋放的成分可以進行準確的定量分析。本方法的加標回收率79．8%～90．6%，相對標準偏差為4．4%～8．0%，分析結果可靠。本方法為天然花香揮發物含量的監測和分析提供了參考。

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Thiswork was supported by the National Natural Science Foundation of China(Nos．31170276，31300271)

Determination of Red Freesia Flower Volatiles with Indirect Headspace Solid Phase Microextraction Coupled to Gas Chromatography and Mass Spectrometry

LIU Bao-Feng，GAO Feng-Zhang，FANG Qiang，WANG Li*
(Institute of Genetics and Cytology，Northeast Normal University，Changchun 130024，China)

A method was established for the analysis of red Freesia flower volatiles by indirect headspace solid phasemicroextraction(HS-SPME)．The gas collecting tubewas used to enrich flower volatiles，and adsorbing materialwas resolved in the extraction solution．Then，the adsorbingmaterialwas analyzed by HS-SPME．The experimental conditions for the quantification of major flower volatiles(linalool，terpineol，ionone and dihydrogen-ionone)were optimized．Florisilwas used as adsorbent，with water-methanol solution(9∶1，V/V) and 0．6 mol/L hydrochloric acid as the extraction solution．The thermal desorption temperature was 70℃ and the extraction time was 25 min．The results showed that the concentration range of linear relationship for linalool and terpineol(R2≥0．981)was 1－100μg/mL，with detection limits of 0．05 and 0．10μg，respectively，and 0．5－50μg/mL for dihydro ionone and ionone(R2≥0．988)with a detection limit of 0．02μg．

RedFreesia;Flower volatiles;Indirect headspacesolidphasemicroextraction;Gas chromatography-mass spectrometry

20 October 2015;accepted 17 December 2015)

10．11895/j．issn．0253-3820．150831

2015-10-20收稿;2015-12-17接受

本文系國家自然科學基金(Nos．31170276，31300271)資助項目

*E-mail:wangli_1955@163．com