H2S處理下小麥葉片蛋白質組表達譜的分析

劉 輝,査日揚,楊 波,劉 艷*

(1.江蘇省連云港市農業科學院,江蘇 連云港 222000;2.揚州大學 農學院,江蘇 揚州 225009;3.江蘇省連云港市黃淮農作物育種研究所，江蘇 連云港 222000)

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H2S處理下小麥葉片蛋白質組表達譜的分析

劉 輝1,2,査日揚3,楊 波1,劉 艷1*

(1.江蘇省連云港市農業科學院,江蘇 連云港 222000;2.揚州大學 農學院,江蘇 揚州 225009;3.江蘇省連云港市黃淮農作物育種研究所，江蘇 連云港 222000)

采用硫氫化鈉作為硫化氫的外源性供體,研究了不同濃度(0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20 mmol/L)硫氫化鈉處理對小麥幼苗葉片蛋白質差異表達譜的影響,以探尋H2S對小麥幼苗生長發育的調控機制。對幼苗葉片的比較蛋白質組學分析發現,不同濃度的硫氫化鈉處理引起了涉及光合作用、糖代謝和能量代謝、氧化還原平衡、蛋白質合成、加工與降解以及信號轉導等途徑的蛋白質的差異表達。我們初步推測,硫化氫可能通過調節參與上述代謝途徑的功能蛋白質的表達量,進而相應地影響到植株的生理與生物量等指標,從而引起植株表型的變化。

硫化氫:小麥；葉片:比較蛋白質組:主成分分析法

植物幼苗影響到植物的生長發育及作物產量。硫化氫(H2S)是繼CO和NO后被發現的第3種氣體信號分子[1],在植物的生長發育和調控植物應對非生物脅迫等過程中發揮重要的作用[2-26](詳見表1);它與其它兩種信號分子一起,協同調節植物體的生理功能。但是有關H2S對植物幼苗的生理功能以及對植物及其蛋白質表達調控作用機制的研究尚未見報道,因此進一步開展H2S調控植物生長發育的相關研究將有助于進一步明確該氣體信號分子的作用機制及作用范疇,從而為植物生長發育機理及植物抗逆研究等提供一定的理論依據。本文以不同濃度的H2S外源性供體NaHS處理小麥幼苗,應用比較蛋白質組學研究用不同濃度H2S處理小麥后其葉片蛋白質的差異表達譜,在蛋白質水平上研究H2S調控植物生理生化過程的可能途徑,旨在探討H2S在小麥幼苗生長發育中的作用。

1　材料和方法

1.1試驗材料

試驗材料為連云港市農業科學院小麥新品種——連麥7號。

挑選顆粒飽滿的種子,用0.1%(v/v)HgCl2消毒10 min,再用去離子水沖洗數次,在25 ℃恒溫暗箱中浸種催芽。在萌發后,選取露白一致的完整種子，用鑷子將它們整齊地擺放在墊有雙層濾紙的培養皿(直徑15 cm)中,加入適量清水,水量以浸沒種子一半為標準,保持培養皿中水量充足。當幼苗長至一葉一心期時,選擇長勢均一、高度4～5 cm的幼苗，用海綿包裹,嵌入打孔泡沫板(厚度1.5 cm)中,每板40株,轉入裝有2 L Hoagland(1/2)營養液的塑料培養桶內,置于HP1000GS型智能人工氣候箱中培養。每日給予12 h光照,強度為1000 μmol/(m2·s),晝夜溫度分別設為28、25 ℃,RH保持在60%～70%。

NaHS購自Aladdin公司。用去離子水將NaHS配成100 mmol/L的母液,現配現用,按所需濃度稀釋即可。

表1　信號分子H2S在植物生長發育中的調節作用

1.2蛋白質組學實驗及方法

1.2.1蛋白樣品的制備采用TCA/丙酮沉淀方法[27]提取小麥葉片與根部的總蛋白。

1.2.2用Bradford方法定量測定蛋白質含量

1.2.2.1制作標準曲線 按表2先加入ddH2O和G250，輕輕晃動混勻后,再加入配好的BSA溶液,靜置2 min后,以超純水為空白,測定其在595 nm下的OD值。再以蛋白質含量為橫坐標,595 nm下的OD值為縱坐標,繪制出光密度-蛋白質濃度標準曲線,得出標準曲線方程為:y=0.0093x+0.0826,R2為0.9967。

1.2.2.2小麥葉和根蛋白濃度測定及結果先將于-80 ℃冷凍的蛋白樣品在室溫下化凍；再用超純水稀釋5倍，根據上述方法測定595 nm處的光密度；最后根據上述標準曲線方程計算出小麥葉和根的蛋白質濃度，結果見表3。

表2　用Bradford法定量測定蛋白質的標準曲線溶液配方

表3　經不同濃度NaHS提取處理的小麥幼苗葉片的蛋白質濃度　μg/μL

1.2.3蛋白質雙向電泳

1.2.3.1蛋白質雙向電泳 參考楊立明等[28]的方法進行蛋白質雙向電泳。

1.2.3.2凝膠掃描和圖像分析使用BIO-RAD凝膠成像系統掃描成像,將凝膠放置在掃描板上,調整焦距與曝光時間后,對凝膠進行掃描成像,保存圖像。使用Quantity One和PDquest軟件分析圖像。

1.2.4蛋白質表達差異分析對每個處理的3塊重復膠的蛋白點相對表達量(體積分數，%)進行比較。

1.2.5蛋白質的膠內酶解用剪掉的槍頭將蛋白點從膠上人工切取,放置在1 mL離心管中,通過胰蛋白酶進行膠內酶解。參考Katayama H[29]的方法,略有改動。用鑷子將蛋白點切成適宜大小后,用超純水清洗兩遍。用100 mmol/L的NH4HCO3和乙腈根據1∶1的體積比配制脫色液。每管加入200μL脫色液,間隔渦旋。脫色3～4次,直至完全脫去考馬斯亮藍的顏色。然后,直接加入乙腈進行脫水,重復2～3次;將裝有蛋白的離心管蓋打開,對稱放置在真空干燥機中,在低溫下真空干燥30～40 min,直至完全干燥。

將10 μg測序級的胰蛋白酶加入到離心管中,根據蛋白點的大小,適量增加酶解液。最后用報紙包裹離心管,倒置在37 ℃培養箱中過夜。

1.2.6蛋白質的質譜鑒定及數據庫檢索使用MALDI-TOF-MS/MS質譜儀進行分析。參考楊立明等[28]的方法進行數據庫檢索。

1.3統計分析方法

使用SPSS 19.0軟件進行數據統計分析。采用One-Way ANOVA法進行單因素方差分析；采用Duncan法進行均值多重比較,以P<0.05為差異顯著的標準。以Pearson相關系數進行距離相關性分析；以主成分法(PCA)提取公因子進行探索性因子分析以及主成分分析。

2　結果與分析

2.1小麥葉片蛋白質雙向電泳圖譜

分別用0(CK)、0.05、0.10 、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20 mmol/L的硫化氫供體硫氫化鈉(NaHS)處理小麥幼苗6 d,取葉片進行雙向電泳實驗,所得圖譜見圖1。在pH 4～7的范圍內8個樣品經考馬斯亮藍G250染色后,經電泳圖譜分析軟件 PDQuest 8.0對各個圖譜的蛋白點進行對比,共獲得93個匹配的蛋白點,這些匹配蛋白點多分布在膠的中上部。

圖中數字為差異表達蛋白點編號,相應箭頭所指為差異蛋白點。A: CK,未用NaHS處理的小麥; B、C、D、E、F、G、H:分別用0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20 mmol/L NaHS處理的小麥。

圖1不同濃度NaHS處理下小麥葉片雙向電泳蛋白表達圖譜

2.2小麥葉片蛋白質表達譜的差異分析

通過對檢測到的蛋白點進行量化分析,找出了至少在1個處理濃度組比對照組蛋白質表達豐度有2倍改變,并且具有顯著性差異的41個蛋白點(P<0.05)。為了清晰展示這些點,在8塊膠上標示出了這些點(如圖2)。

利用MALDI-TOF/MS質譜分析,獲得了41個完整肽指紋圖譜,在NCBI數據庫中導入肽段數據,并用MASCOT軟件進行搜索,最終鑒定出41個蛋白點。根據質譜檢測得到的結果,可獲得該蛋白點匹配的得分值、匹配肽段序列覆蓋率,并在NCBI和ExPASY,通過GI號,查詢到匹配率最高的蛋白名稱及其理論等電點和分子量(見表4)。

將這41種差異表達蛋白點在不同處理濃度下與對照差異表達量比值數據用Mev軟件進行聚類分析，使用的是皮爾遜相關(Pearson’s corrleation)和平均連鎖聚類(Average linkage clustering)，聚類分析結果見圖2。

如圖2所示,聚類分析將差異表達蛋白分為7類。第1類蛋白表達量在0.20 mmol/L與1.60 mmol/L處理組出現相互接近的峰值,并且蛋白表達量都比對照組高2～18倍,從上向下按順序分別是依賴硫氧還蛋白過氧化物酶(thioredoxin-dependent peroxidase)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase)、錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase)、D-蛋白(D-protein)。根據蛋白質的功能,可以看出第1類為氧化還原蛋白類,正是這些氧化還原蛋白表達量的提高,使得1.60 mmol/L NaHS能夠有效緩解自身高濃度產生的抑制作用,在形態、生理生化指標上達到與0.20 mmol/L處理組相近的水平。第2類蛋白質表達的主要特點是在0.05 mmol/L和0.10 mmol/L NaHS處理下,表達量是對照組的2～5倍,在0.20 mmol/L處理組為波谷值。此類蛋白主要是能量代謝、氨基酸代謝和氧化還原平衡類蛋白,在低濃度處理下這些蛋白高水平表達促進小麥幼苗生長發育。第3類為光合相關蛋白,都在0.20 mmol/L處理組為峰值。縱向分析全部差異表達蛋白在各個濃度組的表達情況，發現：在0.20 mmol/L NaHS處理下,小麥幼苗葉片中存在多個高水平表達的蛋白質,且與左右處理濃度組相比,表達量更高;16.0 mmol/L處理組也具有相似的趨勢,比左右處理組的表達量高；0.10 mmol/L處理組與0.05 mmol/L處理組的差異表達蛋白質具有相似的表達水平。

表4　不同NaHS處理下小麥葉片差異表達蛋白鑒定結果

根據右下側的顏色標度,圖中不同顏色代表蛋白點在整塊膠上體積的平均值。

2.3小麥葉片差異表達蛋白的功能鑒定及分析

采用Matrix science網站的Mascot檢索程序,進行數據庫檢索分析。鑒定出的蛋白種類有1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亞基、放氧復合體1、磷酸甘油酸脫氫酸、磷酸丙糖異構酶、錳超氧化物歧化酶、抗壞血酸過氧化物酶、mRNA結合蛋白前體等。參考GO分類的標準和相關文獻,將這些差異表達蛋白分為能量代謝(糖代謝)相關蛋白(占比27%)、氧化還原平衡類蛋白(19%)、光合過程相關蛋白(15%)、蛋白質生物合成(10%)、信號轉導(5%)、蛋白質降解(5%)、蛋白質加工與折疊(12%)、氨基酸代謝(7%),見圖3。

2.4不同濃度NaHS處理組葉片蛋白差異表達量的主成分分析

為了進一步探究樣品間的關系,我們進行了主成分分析。以41個葉片差異表達蛋白的表達量為指標,應用主成分法分析,提取出2個主成分,其解釋方差變異的累計貢獻率達到86.8%。計算各個NaHS處理組在主成分1、2上的特征向量,結果見表5。分別以主成分1、2為橫、縱坐標軸,可得到各個NaHS處理組在主成分1、2的分布情況,如圖4。分析可知：第一主成分最主要代表1.60 mmol/L處理組,而0.20 mmol/L處理組在第二主成分上的特征向量值最高,這兩個濃度處理下多個蛋白質表達與其他組相比差異度最大；而NaHS濃度為0.05、0.10、0.40、0.80 mmol/L處理組多個差異表達蛋白具有相似的表達水平,圖4顯示它們聚在一起。

如圖5所示,在這41個差異表達蛋白點中,橢圓框中蛋白點的表達量在0～0.20 mmol/L處理組中隨濃度升高而逐漸下降,在0.20 mmol/L處理組蛋白表達水平上升,但未超過CK；在更高濃度組蛋白表達水平出現顯著下降趨勢。長方形框中蛋白點在0.20 mmol/L處理組的表達量高于CK的,而且隨濃度升高,在主成分1主要代表的1.60 mmol/L處理組的表達量比左右濃度組高,為極大值,所以這幾種蛋白分布在第一象限,在兩個主成分上都有較高的特征向量值。這與之前的聚類分析結果相吻合；蛋白點29、31、40在1.60 mmol/L處理組出現高表達水平,比左右處理組的高,為極大值,這3個點分別為葉綠體內囊體氧發生系增強蛋白、ATP酶和依賴硫氧還蛋白過氧化物酶,其為氧化還原平衡與能量代謝相關蛋白,這可能是經1.60 mmol/L處理后小麥幼苗葉片在形態和生理生化指標上出現上升趨勢的內在原因。

圖3　不同濃度NaHS處理下小麥幼苗葉差異表達蛋白的功能分類

圖中數值表示NaHS處理濃度(mmol/L)

圖5　小麥葉片差異表達蛋白點主成分分析及功能分類

3　結論與討論

對小麥幼苗葉片差異蛋白質的表達量進行聚類分析,研究發現,與光合作用相關的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亞基、3-磷酸甘油醛脫氫酶、二磷酸核酮糖羧化酶大鏈、葉綠體磷酸核酮糖激酶、放氧復合體的表達量在低濃度處理時均上調,在1.60 mmol/L和3.20 mmol/L處理時均下調。1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亞基是羧化酶的活性亞基,3-磷酸甘油醛脫氫酶是CO2還原階段的重要酶,這兩個蛋白在植物光合過程中CO2固定和光呼吸的調節,以及決定凈光合作用的過程中起關鍵作用。表明信號分子H2S影響了光合作用電子傳遞及碳同化兩個主要過程的進行。低濃度H2S處理促進了光合作用的進行,植株高度增加,生物量增加；而在處理濃度增加后,抑制了光合作用的進行,植株生長受到抑制。本研究還發現，葉片中與植物光合作用和能量代謝(糖代謝)有關的蛋白占的比例比較大,而且表達量大。這說明H2S是通過影響與光合作用有關酶的活化、CO2的活化、光系統單位和電子傳遞鏈構成來影響和調節光合作用的。該研究結果對指導小麥構建高光效群體、延緩后期葉片衰老、增加光合勢和光合產物提供了理論依據。

表5　不同NaHS處理小麥葉片差異蛋白表達的主成分分析結果

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(責任編輯:黃榮華)

Expression Profile Analysis of Proteome in Wheat Leaves Treated with H2S

LIU Hui1,2, ZHA Ri-yang3, YANG Bo1, LIU Yan1*

(1. Lianyungang Academy of Agricultural Sciences in Jiangsu Province, Lianyungang 222000, China; 2. College of Agronomy, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China; 3. Lianyungang Institute of Crop Breeding for Huang-Huai River Basin in Jiangsu Province, Lianyungang 222000, China)

In order to explore the action mechanism of H2S on wheat growth and development, we researched the expression profile of protein in wheat seedling leaves treated with different concentrations (0, 0.05, 0.10, 0.20, 0.40, 0.80, 1.60 and 3.20 mmol/L) of NaHS (an exogenous donor of H2S). The comparative proteomics analysis of wheat seedling leaves found that the treatments with different concentrations of NaHS caused the different expressions of proteins which were involved in the metabolism approaches of photosynthesis, energy metabolism (glucose metabolism), redox equilibrium, protein synthesis, processing and degradation, and signal transduction. We initially concluded that H2S affected the physiological and biomass indexes of wheat plants, thus led to their phenotypic changes by regulating the expression level of above various functional proteins in wheat seedling leaves.

Hydrogen sulfide: Wheat; Leaf: Comparative proteomics; Principal component analysis

2016-05-08

江蘇省普通高校研究生科研創新計劃(CXZZ12-0905)。

劉輝(1979─),男,安徽鳳陽人,助理研究員,在讀博士,從事稻麥新品種選育與應用推廣工作。*通訊作者:劉艷。

S512.1

A

1001-8581(2016)10-0001-07