高內涵分析及Western blotting法在蛋白質核質分布研究中的應用及比較研究

紀曉方　李麗英　常　娜*

(1.首都醫科大學2011級基礎醫學專業，北京 100069；2.首都醫科大學基礎醫學院細胞生物學系 肝臟保護與再生調節北京市重點實驗室，北京 100069)

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· 基礎研究 ·

高內涵分析及Western blotting法在蛋白質核質分布研究中的應用及比較研究

紀曉方1李麗英2常娜2*

(1.首都醫科大學2011級基礎醫學專業，北京 100069；2.首都醫科大學基礎醫學院細胞生物學系 肝臟保護與再生調節北京市重點實驗室，北京 100069)

目的使用不同方法對蛋白質的核質分布進行檢測并比較差異。方法細胞經免疫熒光染色后使用高內涵分析(high content analysis, HCA)對蛋白質的細胞質或細胞核總熒光強度進行分析；分別提取胞質及胞核蛋白，使用Western blotting法對核質組分中的蛋白質含量進行鑒定。結果兩種方法均可檢測到蛋白質的出核轉運；經定量分析，HCA法檢測到的HuR蛋白質/核比升高倍數小于Western blotting法。結論使用HCA法檢測蛋白質核質定位具有準確、客觀、成本低、快捷、多參數等特點，不失為Western blotting的有效補充及替代方法。

高內涵分析；Western blotting；蛋白質核質分布

蛋白質作為一種生物大分子，是組成一切細胞、組織的基本有機物，同時也是生命活動的主要承擔者和各種生物學功能的重要行使者。在細胞中，蛋白質的核質定位是其發揮生物學功能的重要前提之一。因此，如何分析鑒定蛋白質在細胞核及細胞質中的分布對于蛋白質功能的研究有著十分重要的意義。

高內涵分析(high content analysis, HCA)技術是一種基于成像的單細胞水平的多參數細胞分析方法。隨著技術的不斷進步和發展，近年來，HCA在生命科學研究中開始得到了愈發廣泛的應用[1-3]。本實驗以RNA結合蛋白HuR為研究對象，探索了使用HCA研究蛋白質核質分布的實驗方法，并與Western blotting法進行比較。

1　材料與方法

1.1材料

1)細胞：人的肝星形細胞系(LX-2)，來源于美國Scott L Friedman教授實驗室。

2)主要儀器：細胞培養箱(美國 Thermo 公司)，離心機(德國 Eppendorf 公司)，高內涵成像分析系統(美國 Thermo 公司)，Odyssey 紅外熒光掃描成像系統(美國 LI-COR 公司)，垂直電泳裝置及蛋白轉印裝置(美國 Bio-Rad 公司)。

3)主要試劑：DMEM 培養基(美國 Gibco 公司)，胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS)(美國 Hyclone 公司)，轉化生長因子β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1)(美國 PeproTech 公司)，來普霉素B (lemptomycin B, LMB)及其他生化試劑(美國 Sigma 公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養及處理

將LX-2接種于100 mm培養皿中，加入10 mL完全培養基[含DMEM + 10 %(體積分數) FBS + 1 %(體積分數) 青霉素/鏈霉素 + 1 %(體積分數) 的谷氨酰胺]，置于細胞培養箱[37 ℃、5 %(體積分數)CO2]中進行培養。實驗用細胞在達70%～80% 匯合時，更換培養基為無血清培養基，培養12 h后，加TGF-β1 (10 ng/mL) 刺激24 h，收集細胞。此外， LMB (10 nmol/L) 在TGF-β1處理前2 h刺激細胞。

1.2.2細胞免疫熒光及高內涵分析

將細胞接種至96孔板中，接種密度為4×103個/孔；細胞過夜貼壁后對細胞進行處理。用4%(質量分數) 多聚甲醛 4 ℃ 固定細胞(30 min)；PBS洗3次，每次5 min；使用含0.5%(體積分數) Triton X-100 的PBS對細胞進行破膜處理(15 min)；經PBS洗3次×5 min后，使用 2%(質量分數) 牛血清白蛋白于 37 ℃ 封閉30 min；HuR單克隆抗體(美國Santa Cruz公司，1∶200)對細胞進行孵育(4 ℃ 過夜)，同時設置不加抗體組作為陰性對照組；用PBS洗3次×5 min后加入Cy3標記的兔抗小鼠 IgG(美國Jackson Immunoresearch公司，1∶100)于 37 ℃ 孵育1 h；使用核酸染料DAPI(10 μg/mL)染色5 min后，PBS洗3次×5 min；將96孔板用高內涵分析儀(Cell Insight Personal Cell Imager)10×物鏡觀察并拍照；最后采用分析軟件(Thermo Scientific Cellomics iDEV Software)分析所獲取的圖像結果。

1.2.3細胞質/胞核蛋白的分離提取

將細胞接種至60 mm培養皿中，接種密度為4×105個/皿；細胞過夜貼壁后對細胞進行處理。收集細胞；每樣品加入100 μL Buffer A (pH=7.9 10 mmol/L HEPES，10 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，2 mmol/L PMSF，1 μg/mL Aprotinin，1 μg/mL Leupetin)，冰浴15 min；加入12.5 μL 2.5%(體積分數)NP-40，輕彈混勻；4 ℃，4 000 r/min 離心5 min，小心吸取上清液即為胞質蛋白。將提取胞質蛋白所余沉淀用Buffer A洗2～3次以除去殘留的胞質蛋白；加入50 μL Buffer C (pH=7.9 20 mmol/L HEPES，0.45 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，2 mmol/L PMSF，1 μg/mL Aprotinin，1 μg/mL Leupetin)，4 ℃ 混懸15 min；4 ℃，14 000 r/min 離心10 min，上清即為胞核蛋白。

1.2.4Western blotting及定量分析

對蛋白樣品進行定量后，分別取50 μg胞質蛋白及5 μg胞核蛋白進行蛋白質變性處理(99℃，10 min)；隨后進行聚丙稀酰胺凝膠電泳(80 V，2 h)及濕式轉印(250 mA，1.5 h)；將PVDF膜用含5%(質量分數) 脫脂奶粉的TBS(20 mmol/L Tris-HCl pH=7.5，150 mmol/L NaCl)室溫封閉1 h；使用HuR抗體(1∶1 000)、Tubulin抗體(美國Cell Signaling公司，1∶1 000)或HDAC1抗體(美國Santa Cruz公司，1∶250)4℃ 孵育過夜；TBS漂洗3次，每次5 min；加入IRDyeTM 800標記的二抗(美國 LI-COR 公司，1∶10 000)于室溫孵育1 h；TBS漂洗3次，每次5 min；使用Odyssey紅外熒光掃描成像系統直接對PVDF膜進行掃描成像。最后對Western blotting 條帶進行定量分析：將Western blotting結果的圖像文件，用Odyssey 紅外熒光掃描成像系統計算單位吸光度值和條帶面積，將各實驗樣品的總吸光度值與內參照 β-Tubulin或HDAC1進行比較，得到相對百分數。

1.3統計學方法

2　結果

2.1HuR在LX-2中的表達

免疫熒光結果顯示，在LX-2中有HuR蛋白表達，且主要定位于細胞核中(圖1)。

2.2使用HCA對HuR的核質分布進行鑒定

使用TGF-β1對細胞進行處理后進行免疫熒光染色，可見HuR蛋白從細胞核轉位至細胞質中。同時使用核轉運體抑制物LMB對細胞進行預處理，可明顯阻斷TGF-β1誘導的HuR蛋白出核(圖2A)。使用HCA對細胞核及細胞質中的總熒光強度進行統計分析也得到了同樣的結果，經TGF-β1處理后，HuR蛋白的質/核比為對照組的1.47倍，而在LMB預處理細胞中，HuR蛋白的質/核比基本沒有改變(1.06倍)(圖2B，表1)。

圖1　HuR蛋白在LX-2中的表達

The representative images of immunostaining for HuR (red) in LX-2. Cells were co-stained with DAPI to identify nuclei (blue). Scale bars=25 μm. Ctrl: control.

圖2　高內涵分析方法分析HuR蛋白在LX-2中的核質分布

A：representative images of immunofluorescence； B：immunostaining for HuR (Red) counted by high content analysis.*P<0.05vscontrol group,n=3;#P<0.05vsTGF-β1 group,n=3. Ctrl: control; TGF-β1: transforming growth factor-β1; LMB: lemptomycin B；HCA：high content analysis.

表1HCA法檢測不同處理組細胞中HuR蛋白的質/核比分析

GroupCytoplasmicfluorescenceintensityNuclearfluorescenceintensityCytoplasmic/nuclearControl22080．29±255．9664944．32±5217．760．34±0．03TGF?β129235．23±1953．1158130．17±3299．440．50±0．05?LMB22022．61±1900．6170800．96±4461．740．31±0．03HGF?β1/LMB24034．80±260．8765998．65±3046．500．36±0．02Δ　　Dataarepresentedasthex±SEderivedfromatleastthreeindependentexperiments．?P<0．05vscon?trolgroup，n=3；△P<0．05vsTGF?β1group，n=3．HCA：highcontentanalysis；TGF?β1：transforminggrowthfactor?β1；LMB：lemptomycinB．

2.3使用Western blotting法對HuR的核質分布進行鑒定

使用TGF-β1及LMB對細胞進行處理后，分別提取胞質及胞核蛋白進行Western blotting法分析，TGF-β1誘導了HuR蛋白出核(4.18倍)而LMB可明顯阻斷此過程(0.96倍)(圖3,表2)。

圖3　Western blotting法分析HuR蛋白在LX-2中的核質分布

LX-2 were pre-treated with LMB (10 nmol/L) for 2 hours and followed by TGF-b1 treatment for 24 hours. Cytoplasmic or nuclear HuR (cyto-HuR or nuc-HuR) protein expressions were evaluated by Western blotting analysis. The intensity of each band was quantified and normalized to b-Tubulin or HDAC1. TGF-β1: transforming growth factor-β1; LMB: lemptomycin B; HDAC1: histone deacetylase 1; Cyto-HuR: cytoplasmic HuR protein; Nuc-HuR: nuclear HuR protein.

表2Western blotting法檢測不同處理組細胞中HuR蛋白的質/核比分析

GroupCytoplasmicHuRNuclearHuRCytoplasmic/nuclearControl1．00±0．001．00±0．001．00±0．00TGF?β11．96±0．13?0．47±0．05?4．18±0．14?LMB1．01±0．111．02±0．120．99±0．08TGF?β1/LMB0．99±0．09△1．03±0．05△0．96±0．12△

*P<0.05vscontrol group,n=3；△P<0.05vsTGF-β1 group,n=3; TGF-β1: transforming growth factor-β1; LMB: lemptomycin B.

3　討論

RNA結合蛋白HuR，又被稱為HuA，是胚胎致死異常視覺樣蛋白家族的重要成員，幾乎可以在所有的組織中表達[4]。通過識別并結合位于mRNA上的AU-富集元件，HuR可以調節靶mRNA的剪接加工、成熟mRNA向細胞質的轉移、mRNA的穩定性及蛋白質翻譯過程[5-8]。細胞中，HuR既可以位于細胞核內，也可以出現在細胞質中，且其不同的核質定位賦予了HuR不同的生物學功能[9]。因此，如何分析鑒定HuR蛋白在細胞核及細胞質中的分布對于研究其功能有著至關重要的作用。目前已有報道[10]指出，TGF-β1可誘導HuR蛋白向細胞質中富集，因此本實驗使用TGF-β1誘導HuR的出核，并使用核轉運體抑制物LMB對此過程進行阻斷。結果證實，TGF-β1可誘導HuR蛋白由細胞核向細胞質中進行轉運，而LMB可阻斷此過程。

高內涵分析以微板(96孔板)作為實驗載體，細胞經免疫熒光染色后，通過熒光成像系統進行信息采集，并經專用分析系統進行多指標數據分析，最終可高效率地獲取細胞內及細胞間的綜合細胞學信息。HCA具有全自動、多靶點、可定量、靈敏、多參數等特點。目前，HCA技術已廣泛應用于藥物篩選、細胞信號通路研究、腫瘤學、神經生物學、干細胞研究等諸多領域[1-3, 11]。本實驗使用HCA法及Western blotting法對蛋白質的出核轉運進行了檢測。結果發現，兩種方法均可檢測到HuR蛋白的出核轉運。經定量分析，HCA法檢測到的HuR蛋白質/核比升高倍數小于Western blotting法。但與Western blotting法相比，HCA法依然具有極大優勢：

1)定量分析準確、客觀：使用Western blotting法進行定量分析時，需要分別計算條帶的單位吸光度值和條帶面積，將各實驗樣品的吸光度值與內參照b-Tubulin或HDAC1進行比較，繼而得到相對百分數，在此過程中容易產生較大的誤差，且在計算時，人為因素也會對最終結果產生較大影響，因此Western blotting法并不能對蛋白質的表達進行完全準確的定量分析；而HCA法最大限度的排除了人為偏差，由儀器自動、客觀的按照統一標準對大量細胞同時進行觀察和分析，從圖像中得到細胞群體的定量統計結果，因此結論更為精確。

2)實驗操作簡單，耗時短：當使用傳統的Western blotting法對蛋白質的核質定位進行分析時，需要分別提取胞質蛋白及胞核蛋白，全部實驗需要耗時3～4 d完成；而HCA法僅需對細胞進行免疫熒光染色，之后的信息采集及數據分析可由儀器全自動完成，實驗操作減少，在2 d內即可完成全部實驗。

3)高通量，節約成本:除操作簡單且實驗耗時短以外，HCA法可同時對多個樣品進行檢測。以96孔板為例，使用HCA法分析蛋白質核質分布時，一次實驗可最多完成32種不同處理(每組設3個平行樣本)的檢測；若使用Western blotting法完成同樣數量的樣品檢測，工作量將大大增加。同時，使用Western blotting法檢測蛋白質核質定位時，需要4×105～1×106個細胞才可保證蛋白濃度足以完成實驗，而HCA法僅需2×103～4×103個細胞即可，所需細胞量的減少及培養體系的縮小可極大的節約實驗耗材及試劑用量,最大限度地減少了實驗成本。

4)可進行多參數分析:當使用HCA法對蛋白質核質定位進行檢測時，除分析細胞質及細胞核中的蛋白質熒光染色強度以外，還可獲取蛋白質的免疫熒光染色圖片。經不同的程序設定，HCA法可完成對同一批細胞樣品其他生物學參數的分析，例如單個細胞圖像和各項指標、細胞數量和形態的改變、核質結構的變化等。而Western blotting法僅可完成對蛋白質含量的定性及半定量分析，顯然無法在同一次實驗中同時完成上述內容。

綜上所述，使用HCA法檢測蛋白質核質定位具有定量準確、客觀、成本低、操作簡便、快捷、多參數等特點，不失為傳統Western blotting法的有效補充及替代方法。

[1]Moore D L, Blackmore M G, Hu Y, et al. KLF Family members regulate Intrinsic axon regeneration ability[J]. Science， 2009, 326(5950): 298-301.

[2]Loh S H, Francescut L, Lingor P, et al. Identification of new kinase clusters required for neurite outgrowth and retraction by a loss-of-function RNA interference screen[J]. Cell Death Differ,2008, 15(2): 283-298.

[3]Gasparri F, Ciavolella A, Galvani A. Cell-cycle inhibitor profiling by high-content analysis[J]. Adv Exp Med Biol,2007, 604: 137-148.

[4]Ma W J, Cheng S, Campbell C, et al. Cloning and characterization of HuR, a ubiquitously expressed Elav-like protein[J]. J Biol Chem, 1996, 271(14): 8144-8151.

[5]Abdelmohsen K, Panda A C, Kang M J, et al. 7SL RNA represses p53 translation by competing with HuR[J]. Nucleic Acids Res,2014, 42(15): 10099-10111.

[6]Chang N, Yi J, Guo G, et al. HuR uses AUF1 as a cofactor to promote p16INK4 mRNA decay[J]. Mol Cell Biol, 2010, 30(15): 3875-3886.

[7]Yi J, Chang N, Liu X, et al. Reduced nuclear export of HuR mRNA by HuR is linked to the loss of HuR in replicative senescence[J]. Nucleic Acids Res,2010, 38(5): 1547-1558.

[8]Woo J H, Lee J H, Kim H, et al. MAP kinase phosphatase-1 expression is regulated by 15-deoxy-Delta12,14-prostaglandin J2 via a HuR-dependent post-transcriptional mechanism[J]. Biochim Biophys Acta, 2015, 1849(6): 612-625.

[9]Fan X C, Steitz J A. Overexpression of HuR, a nuclear-cytoplasmic shuttling protein, increases the in vivo stability of ARE-containing mRNAs[J]. EMBO J, 1998, 17(12): 3448-3460.

[10]Bai D, Gao Q, Li C, et al. A conserved TGFbeta1/HuR feedback circuit regulates the fibrogenic response in fibroblasts[J]. Cell Signal, 2012, 24(7): 1426-1432.

[11]Carlson-Stevermer J, Goedland M, Steyer B, et al. High-content analysis of CRISPR-Cas9 gene-edited human embryonic stem cells[J]. Stem Cell Reports,2016, 6(1): 109-120.

編輯慕萌

， E-mail：changna@ccmu.edu.cn

Comparison between different methods to detect the subcellular localization of proteins

Ji Xiaofang1, Li Liying2, Chang Na2*

(1.Grade2011inDepartmentofBasicMedicine,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China; 2.DepartmentofCellBiology,SchoolofBasicMedicalSciences,MunicipalLaboratoryforLiverProtectionandRegulationofRegeneration,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

ObjectiveTo compare different methods for detecting the subcellular localization of proteins. MethodsUsing high content analysis to count the cytoplasmic or nuclear fluorescence intensity of proteins. ResultsCytoplasmic or nuclear proteins were separated and detected by Western blotting. ConclusionThe cytoplasmic translocation of protein was detected by these two different methods conclusion high content analysis is better than Western blotting for detecting the subcellular localization of proteins.

high content analysis; Western blotting; subcellular localization of protein

國家自然科學基金(31301154)，北京市屬高等學校創新團隊建設與教師職業發展計劃項目(IDHT20150502)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (31301154), Project of Construction of Innovative Teams and Teacher Career Development for Universities and Colleges Under Beijing Municipality (IDHT20150502).

時間：2016-10-1611∶00

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20161016.1100.046.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2016.05.012]

Q 26

2016-03-01)