螯合鋅離子對局灶性腦缺血再灌注大鼠半暗帶區(qū)低氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)的影響

房亞蘭　李　森　趙詠梅　閆　峰　尹　潔　羅玉敏　劉克建

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院 北京市老年病醫(yī)療研究中心 神經(jīng)變性病教育部重點實驗室 腦血管病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)北京市重點實驗室，北京 100053)

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· 基礎(chǔ)研究 ·

螯合鋅離子對局灶性腦缺血再灌注大鼠半暗帶區(qū)低氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)的影響

房亞蘭李森趙詠梅*閆峰尹潔羅玉敏劉克建

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院 北京市老年病醫(yī)療研究中心 神經(jīng)變性病教育部重點實驗室 腦血管病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)北京市重點實驗室，北京 100053)

目的利用大腦中動脈梗塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)大鼠模型，觀察腦缺血再灌注后腦組織低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)表達(dá)的動態(tài)變化，并給予腦缺血大鼠鋅離子螯合劑[N,N,N’,N ’-tetrakis(2-pyridylmethyl) ethylenediamine, TPEN]進(jìn)行干預(yù)，研究鋅離子對MCAO大鼠腦組織HIF-1α表達(dá)的影響，探討鋅離子介導(dǎo)腦缺血再灌注損傷的相關(guān)機制。方法采用數(shù)字表法將45只健康雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分為3組:假手術(shù)組(Sham)、MCAO組和MCAO+TPEN組(于MCAO前30 min腹腔注射TPEN，劑量為15 mg/kg)，每組15只。使用線栓法制作大鼠右側(cè)大腦中動脈缺血90 min再灌注模型。術(shù)中監(jiān)測大鼠肛溫及平均動脈壓，使其維持在正常范圍。分別于再灌注3、12和24 h處死大鼠，迅速取腦，用免疫組化染色檢測大鼠腦組織冰凍切片內(nèi)缺血半暗帶區(qū)HIF-1α的表達(dá)水平，用免疫熒光雙標(biāo)對HIF-1α在缺血腦組織的表達(dá)進(jìn)行細(xì)胞定位。結(jié)果假手術(shù)組大鼠未見HIF-1α染色陽性細(xì)胞，MCAO組大鼠腦組織缺血半暗帶區(qū)HIF-1α的表達(dá)隨再灌注時間延長逐漸增加(P<0.01)。給予15 mg/kg TPEN后，缺血再灌注各時間點大鼠腦組織缺血半暗帶區(qū)內(nèi)HIF-1α的表達(dá)比MCAO組明顯減少(P<0.01)。缺血再灌注大鼠腦組織缺血半暗帶區(qū)內(nèi)，HIF-1α免疫熒光染色與神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN免疫熒光染色共定位。結(jié)論大鼠局灶性腦缺血再灌注后，腦組織神經(jīng)元內(nèi)HIF-1α表達(dá)隨再灌注時間延長遞增。螯合細(xì)胞內(nèi)鋅離子下調(diào)缺血再灌注大鼠腦內(nèi)HIF-1α濃度，提示鋅離子可能通過促進(jìn)HIF-1α表達(dá)介導(dǎo)腦缺血損傷。

鋅離子；低氧誘導(dǎo)因子-1α；腦缺血；再灌注；大鼠

缺血性腦血管病具有高發(fā)病率、高致殘率、高病死率的特點，是嚴(yán)重威脅人類健康的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一[1]。腦缺血損傷過程涉及多種病理機制，如炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和過量的一氧化氮產(chǎn)生等。早期應(yīng)用重組織纖溶酶原激活劑進(jìn)行靜脈溶栓，是目前臨床上唯一有效的治療手段，但是溶栓的時間窗短及出血風(fēng)險限制了其在臨床治療中的應(yīng)用[2]。鋅離子是體內(nèi)含量豐富的微量元素，能與谷氨酸鹽一起以突觸小泡的形式釋放到突觸間隙，進(jìn)入突觸后神經(jīng)元細(xì)胞[3-4]。研究[5-6]表明，鋅離子在缺血性腦損傷過程中發(fā)揮了重要作用。但是其相關(guān)作用機制尚不十分清楚。

低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)是廣泛存在于機體細(xì)胞中的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[7]，大腦缺血、缺氧損傷后，機體會誘導(dǎo)一系列的基因轉(zhuǎn)錄，HIF-1可調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)，通過產(chǎn)生抗凋亡產(chǎn)物和促進(jìn)血管生成等作用修復(fù)腦缺血、缺氧損傷[8-9]。然而，有關(guān)HIF-1是否參與鋅離子介導(dǎo)腦缺血損傷的過程，目前尚無研究報道。

本研究利用大腦中動脈梗塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)大鼠模型，研究再灌注后HIF-1α在腦組織的動態(tài)變化，同時，給MCAO大鼠應(yīng)用鋅離子螯合劑[N,N,N’,N ’-tetrakis(2-pyridylmethyl) ethylenediamine, TPEN]，觀察其對HIF-1α表達(dá)的影響，研究鋅離子介導(dǎo)腦缺血損傷的相關(guān)作用機制。

1　材料和方法

1.1主要儀器設(shè)備

小動物反饋式溫度調(diào)節(jié)儀(Harvard Apparatus公司，美國)、手術(shù)顯微鏡(Carl Zeiss公司，德國)、雙極電凝器(德威，DEVEL，ACC100)、冰凍切片機(Thermo Fisher Scientific公司，美國)、顯微鏡(Nikon公司， Digital Imaging hero edipse 80i，日本)。

1.2試劑

恩氟烷(河北一品制藥有限公司)；OCT包埋劑(櫻花公司，美國)； HIF-1α抗體(Novus公司，美國)；NeuN抗體(Millipore公司，美國)等。

1.3實驗動物及動物分組

健康雄性Sprague-Dawley大鼠(購自北京維通利華實驗動物公司)，體質(zhì)量280～300 g, 實驗動物許可證號：SCXK(京) 2012-0001，飼養(yǎng)于SPF級動物實驗室。采用數(shù)字表法將45只大鼠隨機分成3組：假手術(shù)組(Sham)；MCAO組；MCAO+TPEN組。按照再灌注時間又將每組分為3、12及24 h 3個時間點，每個時間點5只大鼠。TPEN溶于10%(體積分?jǐn)?shù)) DMSO中，MCAO+TPEN組于缺血前30 min腹腔一次性注射TPEN，劑量為15 mg/kg，Sham組和MCAO組腹腔注射同等體積的10%(體積分?jǐn)?shù))DMSO。

1.4動物模型制作

MCAO大鼠模型采用改良ZeaLonga法[10]制備。用混合70%(體積分?jǐn)?shù)) N2O、30%(體積分?jǐn)?shù)) O2的5%(體積分?jǐn)?shù))恩氟烷誘導(dǎo)麻醉大鼠，并用面罩吸入混合70% (體積分?jǐn)?shù))N2O、30%(體積分?jǐn)?shù))O2，2%(體積分?jǐn)?shù))恩氟烷維持麻醉。固定大鼠于手術(shù)操作臺，沿頸部正中線切口，分離右側(cè)的頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈，由頸外動脈殘端將頭端直徑0.38 mm的尼龍線栓插入頸內(nèi)動脈，直至距頸內(nèi)動脈和頸外動脈分叉處約18 mm。在手術(shù)過程中，使用反饋性控溫毯監(jiān)測大鼠肛溫，將其維持在36.5～37.5℃。監(jiān)測平均動脈壓，使其保持在正常范圍。缺血90 min后，將線栓小心地拔出進(jìn)行再灌注。

1.5免疫組織化學(xué)染色

將腦組織進(jìn)行連續(xù)冰凍切片，厚度20 μm。切片于4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛中固定10 min，然后放入含3%(體積分?jǐn)?shù))雙氧水的甲醇溶液中孵育5 min，PBS沖洗后，加5%(體積分?jǐn)?shù))正常山羊血清室溫孵育10 min，傾去血清，加一抗(HIF-1α 1∶170)，4 ℃孵育過夜。次日用PBS 沖洗，滴加生物素標(biāo)記的二抗(1∶200)，室溫孵育1 h。PBS沖洗，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育1 h。PBS沖洗，DAB顯色。切片經(jīng)脫水、透明、封片后，顯微鏡下觀察。陰性對照組不加一抗。

免疫組化定量分析：每只大鼠從前囟前0.6 cm到前囟后0.2 cm連續(xù)冰凍切片,每隔5張取1張，共選取3張，于顯微鏡下記錄每組大鼠腦皮質(zhì)缺血半暗帶區(qū)HIF-1α陽性染色細(xì)胞數(shù)目，用于統(tǒng)計分析。

1.6免疫熒光雙標(biāo)

首先將新鮮冰凍切片于4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛中固定10 min，PBS沖洗，然后用含0.2%(體積分?jǐn)?shù)) TritonX-100的PBS孵育10 min，PBS沖洗后，加5%(體積分?jǐn)?shù))的正常山羊血清室溫封閉30 min，滴加一抗(HIF-1α 1∶200和NeuN 1∶300)，4 ℃孵育過夜。次日取出切片，PBS沖洗，滴加熒光二抗(1∶300)，室溫避光孵育1 h。PBS沖洗，最后用含DAPI(4’,6-diamidino-2-phenylindole)的封片劑封片。熒光顯微鏡觀察。陰性對照組用PBS代替一抗。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1MCAO大鼠腦缺血半暗帶區(qū)HIF-1α表達(dá)隨再灌注時間延長遞增

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，Sham組大鼠腦組織于再灌注3、12和24 h均未見HIF-1α陽性染色細(xì)胞；MCAO組大鼠再灌注各時間點腦缺血半暗帶區(qū)均可見HIF-1α陽性染色細(xì)胞，高倍鏡下HIF-1α陽性染色細(xì)胞的胞體呈黃褐色，胞核褐色深染，細(xì)胞突起明顯(圖1A)。并且隨著再灌注時間的延長，HIF-1α陽性染色細(xì)胞數(shù)量遞增(P<0.01，圖1B)。

2.2鋅離子螯合劑TPEN減少MCAO大鼠腦缺血半暗帶區(qū)HIF-1α表達(dá)

與MCAO組相比，MCAO+TPEN組大鼠于再灌注3、12和24 h 時間點腦缺血半暗帶區(qū)HIF-1α陽性染色細(xì)胞數(shù)目均顯著減少(圖1A)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖1B)。

2.3MCAO大鼠腦缺血半暗帶區(qū)域HIF-1α與NeuN共定位

HIF-1α陽性細(xì)胞主要分布于MCAO大鼠損傷側(cè)皮層、基底節(jié)及海馬區(qū)，其胞體呈綠色熒光。NeuN陽性細(xì)胞呈紅色熒光。所有細(xì)胞的胞核呈藍(lán)色熒光。圖像合并后，可見綠色熒光和紅色熒光重合，呈現(xiàn)粉色，說明HIF-1α與神經(jīng)元共定位，該結(jié)果表明，缺血再灌注損傷后腦組織神經(jīng)元內(nèi)HIF-1α表達(dá)增加(圖2)。

圖1　Sham組、MCAO組及TPEN組大鼠不同再灌注時間點腦缺血半暗帶區(qū)HIF-1α免疫組化染色結(jié)果

A：representative results of HIF-1α-immunohistochemical staining in Sham group, MCAO group and MCAO+TPEN group rats. Bar=50 μm; B: comparison of HIF-1α-immunohistochemical cell numbers in Sham, MCAO and MCAO+TPEN group rats.**P<0.01vsSham group,##P<0.01vsMCAO group; MCAO: middle cerebral artery occlusion；TPEN：N,N,N’,N ’-tetrakis(2-pyridylmethyl) ethylenediamine；HIF-1α：hypoxia inducible factor-1α.

圖2　Sham組、MCAO組大鼠再灌注24 h腦缺血半暗帶區(qū)HIF-1α/NeuN免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果

Representative double immunofluorescence staining for HIF-1α (green) and neuron-specific NeuN (red) at 24 h after reperfusion. White arrows indicate cells labeled with HIF-1α, NeuN, or double labeled with both. Bar=20 μm. MCAO: middle cerebral artery occlusion; DAPI: 4’,6-diamidino-2-phenylindole；HIF-1α：hypoxia inducible factor-1α.

3　討論

腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機制十分復(fù)雜，涉及多種因素，鋅離子在此過程中發(fā)揮了重要作用[10-12]。本課題組的研究[5]表明，MCAO大鼠再灌注24 h內(nèi)，腦缺血半暗帶區(qū)的鋅離子陽性染色細(xì)胞數(shù)目隨再灌注時間的延長而增多，并且鋅離子陽性細(xì)胞數(shù)量與腦梗死體積比率呈正相關(guān)。本課題組的研究[5]表明，給予MCAO大鼠TPEN能降低細(xì)胞內(nèi)鋅離子濃度，減少神經(jīng)元凋亡，減小腦梗死體積，改善神經(jīng)功能評分，并顯著降低MCAO大鼠病死率，表明鋅離子參與腦缺血再灌注損傷。

HIF-1是由α、β亞單位構(gòu)成的異源蛋白二聚體。在低氧條件下，HIF-1調(diào)控許多基因的表達(dá)，使機體能更好地適應(yīng)低氧環(huán)境[13-14]。HIF-1β在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，HIF-1α是誘導(dǎo)型亞基，受到缺血缺氧刺激時，從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞存活，HIF-1α的表達(dá)上調(diào)與細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)[15]。本研究通過檢測神經(jīng)元內(nèi)HIF-1α的表達(dá)情況，探討鋅離子參與腦缺血再灌注損傷的可能機制。

文獻(xiàn)[16-19]報道，新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后HIF-1α表達(dá)增高，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，MCAO大鼠再灌注3 h即能觀察到半暗帶區(qū)HIF-1α表達(dá)，隨再灌時間延長，HIF-1α表達(dá)逐漸增多，直至再灌注后24 h，提示在腦缺血再灌注24 h內(nèi)，腦組織損傷逐漸加重。給予MCAO大鼠15 mg/kg TPEN后，HIF-1α的表達(dá)減少，說明抑制細(xì)胞內(nèi)的鋅離子可下調(diào)HIF-1α的表達(dá)。本研究結(jié)果提示，抑制鋅離子聚積可能通過下調(diào)HIF-1α的表達(dá)，減輕腦缺血再灌注損傷。

本研究免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示，腦缺血再灌注大鼠腦組織缺血半暗帶區(qū)HIF-1α與神經(jīng)元共定位。本課題組[5]最近的研究表明，腦缺血再灌注大鼠腦內(nèi)半暗帶區(qū)的鋅離子與TUNEL熒光染色陽性神經(jīng)元共定位，參與神經(jīng)元凋亡。結(jié)合本研究結(jié)果，進(jìn)一步提示鋅離子通過上調(diào)HIF-1α的表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)元凋亡。

綜上，本研究結(jié)果表明，大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元內(nèi)HIF-1α表達(dá)水平增高，給予鋅離子螯合劑TPEN后，HIF-1α表達(dá)減少，提示缺血后聚積的鋅離子可能通過上調(diào)HIF-1α的表達(dá)，促進(jìn)腦缺血再灌注損傷。本研究為深入探討鋅離子參與腦缺血損傷的相關(guān)機制提供了科學(xué)證據(jù)。

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編輯慕萌

， E-mail：yongmeizhao@hotmail.com

Effect of chelating zinc on expression of hypoxia inducible factor-1α in the penumbra of rats following focal cerebral ischemia/reperfusion

Fang Yalan, Li Sen, Zhao Yongmei*, Yan Feng, Yin Jie, Luo Yumin, Liu Kejian

(XuanwuHospital,CapitalMedicalUniversity,BeijingGeriatricMedicalResearchCenter,KeyLaboratoryofNeurodegenerativeDiseasesofMinistryofEducation,BeijingKeyLaboratoryofTranslationalMedicineforCerebrovascularDiseases,Beijing100053,China)

ObjectiveTo investigate the dynamic changes of hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) during reperfusion in a rat middle cerebral artery occlusion (MCAO)/reperfusion model and the changes of HIF-1α expression by removing zinc with zinc chelator [N,N,N’,N ’-tetrakis(2-pyridylmethyl) ethylenediamine, TPEN]， and to explore the probable mechanism by which zinc involved in cerebral ischemia/reperfusion injury. MethodsForty-five male Sprague Dawley rats were divided into three groups randomly: Sham group, MCAO group, and MCAO+TPEN group [rats received TPEN (15mg/kg, i.p.) once 30 min before MCAO]. There were 15 rats in each group. MCAO operation was performed by using suture method. The rats underwent right MCAO for 90 min. The rectal temperature and mean arterial blood pressure were monitored to keep in normal range during the operation. At 3, 12 or 24 h after reperfusion, brains were removed. The expression and location of HIF-1α were detected by immunohistochemistry and immunofluorescent staining. Results1) No HIF-1α positive cell was observed in the brain of Sham group rats. The number of HIF-1α positive cells in the penumbra of MCAO group showed time-dependent increasing tendency within 24 hours after reperfusion (P<0.01). 2) At 3, 12 and 24 h after reperfusion, the numbers of HIF-1α positive cells in the penumbra of MCAO+TPEN group rats decreased significantly compared with those of MCAO group rats (P<0.01). 3) HIF-1α-positive immunoreactive cells were colocalized with the general neuronal marker, NeuN, in MCAO rats. ConclusionThe level of HIF-1α in neurons increased along with the extension of reperfusion time in focal cerebral ischemia/reperfusion rats. The expression of HIF-1α was decreased by removing intracellular zinc in MCAO rats, suggesting that zinc may be involved in the ischemia/reperfusion injury by promoting the expression of HIF-1α.

zinc; hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α); brain ischemia; reperfusion; rats

國家自然科學(xué)基金(81171242)，北京市自然科學(xué)基金(7122036)，腦血管病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)北京市重點實驗室開放課題(2013NXGZ03)資助。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81171242)，Natural Science Foundation of Beijing (7122036)，Open Project of Beijing Key Laboratory of Translational Medicine for Cerebrovascular Diseases (2013NXGZ03).

時間：2016-10-1610∶58

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20161016.1058.024.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2016.05.014]

R 743

2016-05-30)