甘精胰島素注射液對1型糖尿病模型大鼠的降血糖作用

宋紫輝　張慧霞　項宗尚　范明源　蔡永明　張宗鵬

(天津藥物研究院新藥評價有限公司，天津 300301)

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· 基礎研究 ·

甘精胰島素注射液對1型糖尿病模型大鼠的降血糖作用

宋紫輝△張慧霞△項宗尚范明源蔡永明張宗鵬*

(天津藥物研究院新藥評價有限公司，天津 300301)

目的采用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導的大鼠1型糖尿病(insulin-dependent diabetes mellitus，IDDM)模型，評價甘精胰島素注射液的降血糖作用。方法健康雄性SD大鼠，單次尾靜脈注射2%(質量分數(shù))STZ 58 mg/kg制備IDDM模型，采用隨機數(shù)字表法將造模成功的動物(禁食血糖≥16.7 mmol/L)分為供試品甘精胰島素注射液(glargine injection)低、中和高3個劑量組、參照藥來得時(Lantus)中劑量組和模型對照組，每組15只；同時設正常對照組。各組動物分別皮下注射甘精胰島素、來得時或等體積的溶媒，每天給藥，連續(xù)給藥9周。每周定時檢測大鼠隨機血糖、體質量、攝食量和飲水量；給藥結束后，采用全自動生化分析儀檢測血清中尿素氮(blood urea nitrogen， BUN)、肌酐(creatinine， Cr)、總膽固醇(total cholesterol， TC)和三酰甘油(triglyceride， TG)；采用比色法定量檢測糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin， GHb)。結果與模型對照組相比，甘精胰島素注射液各劑量組大鼠：①體質量增加、攝食量減少；②給藥后1 h血糖開始降低，2 h降至最低，8 h基本恢復到給藥前，且具有劑量依賴性；③GHb不同程度地降低，具有明顯的劑量-效應關系；④血清中BUN和TG降低。結論在4～8 IU/kg劑量范圍內(nèi)，每日皮下注射2次甘精胰島素注射液，明顯改善IDDM模型大鼠的高血糖癥狀，其作用效果與來得時相當；連續(xù)給藥9周后，模型大鼠的血清BUN、TG和GHb顯著降低，提示其具有保護腎功能、調(diào)節(jié)血脂的作用，并能減少糖尿病合并癥的發(fā)生。

鏈脲佐菌素；1型糖尿病；甘精胰島素；糖化血紅蛋白

糖尿病(diabetes mellitus，DM)已成為危害人類健康的全球性難題，尤其1型糖尿病臨床癥狀更為嚴重且患病率以每年2%～5%的增長速度不斷蔓延[1]，其發(fā)生的主要原因是自身免疫介導的胰腺β細胞破壞，從而引起胰島素的缺失，因此患者必須進行外源胰島素的強力治療。甘精胰島素(glargine)作為一種新型長效降糖藥物[2]，其效應-時間曲線更平穩(wěn)，彌補了傳統(tǒng)胰島素注射頻率高、夜間低血糖等缺點，具有獨特的臨床應用優(yōu)勢。鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)是由無色鏈霉菌屬發(fā)酵產(chǎn)生，可以對動物胰島β細胞進行選擇性的破壞。采用大劑量一次性注射的方法可以造成動物持續(xù)性高血糖[3]，與人類1型糖尿病臨床表現(xiàn)相似，可作為評價1型糖尿病較為理想的動物模型。本試驗采用STZ誘導的SD大鼠1型糖尿病模型，通過對血糖、血清生物化學指標及糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin，GHb)進行監(jiān)測，研究甘精胰島素對糖尿病大鼠的降血糖作用，為甘精胰島素的臨床藥效學評價提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動物、藥品與主要儀器

SPF級雄性SD大鼠120只，體質量170～220 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，生產(chǎn)許可證號為：SCXK(京)2012-0001，動物質量合格證號為：11400700075484。所有動物均有檢疫證書，研究方案經(jīng)動物福利委員會(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)認證批準。動物飼養(yǎng)于天津藥物研究院新藥評價有限公司動物實驗樓(屏障環(huán)境)，溫度設定范圍20 ℃～26 ℃，濕度設定范圍40 %～70 %，換氣次數(shù)不少于每小時15次全新風，光照時間為12 h明12 h暗交替。大鼠均適應性飼喂11 d后進行正式實驗。

甘精胰島素注射液(glargine injection，300 IU, 3 mL，批號：20130701)，來得時注射液(lantus injection，300 IU, 3 mL，賽諾菲安萬特(北京)制藥有限公司，批號：3B011A)，甘精胰島素注射液溶媒(批號：20130701)，鏈脲佐菌素(1.0 g/支，批號：SLBJ7785V，美國Sigma公司)。

Accu-Chek Performa卓越型血糖儀(瑞士羅氏公司)，血糖試紙(瑞士羅氏公司，批號：473034)，LXJ-IIB冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)，大鼠糖化血紅蛋白檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20150304)，TU-1810D型紫外可見分光光度計、DK-98-II電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器公司)。

1.2試驗方法

1)1型糖尿病(insulin-dependent diabetes mellitus，IDDM)模型的建立：將120只雄性大鼠適應性飼養(yǎng)11 d后禁食18 h后采用刺破尾靜脈取微量血的方法測定空腹血糖，采用數(shù)字表法隨機選15只大鼠作為正常對照組，正常組尾靜脈注射STZ的稀釋溶劑，即檸檬酸鈉緩沖液(0.1 mol/L、pH 4.2)。其余105只大鼠尾靜脈注射質量分數(shù)為2%(質量分數(shù))的STZ溶液，58 mg/kg，造模72 h后連續(xù)3 d監(jiān)測大鼠禁食6 h后的空腹血糖，若連續(xù)3次空腹血糖均≥16.7 mmol/L者視為造模成功。

2)分組與給藥：選擇造模成功的75只大鼠，采用隨機數(shù)字表法將動物分為糖尿病模型對照組、甘精胰島素低劑量組(2 IU/kg)、中劑量組(4 IU/kg)、高劑量組(8 IU/kg)和來得時對照組(4 IU/kg)，每組15只，采用皮下注射方式，每日給藥1次，正常對照組和模型對照組皮下注射給予等體積的溶媒。因連續(xù)給藥2周后甘精胰島素低劑量組未檢測到降血糖作用，所以調(diào)整給藥劑量，即低劑量組(4 IU/kg)、中劑量組(6 IU/kg)、高劑量組(8 IU/kg)和來得時對照組(6 IU/kg)；給藥頻率調(diào)整為每日2次，繼續(xù)給藥7周。

3)血糖、體質量、攝食量和飲水量的測定：采用刺破尾靜脈取微量血的方法檢測大鼠的隨機血糖，給藥后的第1天、7天(第1周)、63天(第9周)檢測全點餐后血糖，具體時點為0 h(給藥前)、1、2、5和8 h(給藥后)；第2、3、4、5、6、7和8周檢測0 h(給藥前)及給藥后2 h或5 h餐后血糖值。并以給藥前血糖濃度作為基礎血糖濃度，計算降糖率：降糖率(%)=(基礎血糖濃度-給藥后血糖濃度)/基礎血糖濃度×100，于給藥前及給藥期間每周稱量1次動物空腹體質量(空腹3 h)和每籠(5只/籠)大鼠18 h內(nèi)的飲食量/飲水量。計算每只大鼠約18 h內(nèi)的平均攝食/飲水量：平均攝食/飲水量=(加料/水量—余料/水量)/ 每籠動物只數(shù)。

4)大鼠血清生物化學指標和GHb測定：給藥結束后，大鼠經(jīng)20 %(質量分數(shù))烏拉坦麻醉，腹主動脈取血，采用全自動生化分析儀測定血清中尿素氮(blood urea nitrogen， BUN)、三酰甘油(triglyceride， TG)、肌酐(creatinine， Cr)和總膽固醇(total cholesterol， TC)；比色法測定糖化血紅蛋白。

1.3統(tǒng)計學方法

2　結果

2.1各組大鼠體質量、攝食量和飲水量的比較

給藥期間，甘精胰島素注射液各劑量組和來得時對照組動物體質量均呈增長趨勢，各檢測時點內(nèi)體質量均值均高于同期模型對照組，且從第5周開始均與同期模型對照組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，但均低于正常對照組動物體質量的增長。相同劑量下的供試品與原研對照品相比，體質量增長較為一致，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果詳見圖1A。從第5周開始，甘精胰島素注射液各劑量組和來得時對照組動物的攝食量均值均低于同期模型對照組，中和高劑量組較低劑量組更為明顯。結果見圖1B。各劑量組和來得時對照組動物的飲水量與同期模型對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義。

2.2各組大鼠血糖和降糖率的比較

第9周給藥前，各治療組和模型對照組的血糖值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。給藥后各檢測時點，模型對照組和正常對照組血糖和降糖率與給藥前相比無明顯變化；甘精胰島素注射液各劑量組和來得時對照組的動物血糖濃度在皮下注射給藥后1 h開始下降，并于2 h降至最低，此時，低、中和高劑量組的平均降糖率分別為57.8%、64.6%和70.8%。與模型對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，且具有一定的劑量效應關系；來得時對照組與同劑量甘精胰島素給藥組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。隨給藥時間延長，給藥后5 h血糖濃度逐漸回升，8 h基本恢復到給藥前濃度。結果詳見表1和表2。

圖1　大鼠給藥期平均體質量(A)和攝食量(B)隨時間的變化曲線

Tab.1　Effect of glargine on random fed blood glucose levels after 9 weeks subcutaneous injection administration in rats　, n=15)

*P<0.05vsmodel-control group;**P<0.01vsmodel-control group.

表2　皮下給藥9周后大鼠隨機血糖降糖率

2.3各組大鼠糖化血紅蛋白和血清生物化學指標比較

連續(xù)給藥9周后，正常對照組每10 g血紅蛋白中GHb的吸光度均值為21.3，模型對照組均值為66.2，約為正常對照組的3倍，提示模型對照組的高血糖持續(xù)穩(wěn)定。甘精胰島素注射液低、中和高劑量組大鼠GHb的吸光度均值分別為35.6、30.9和28.5，較模型對照組(66.2)均有明顯地降低(P<0.01)，并具有一定的劑量效應關系；原研對照組吸光度均值為38.4，與供試品甘精胰島素注射液中劑量組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果提示，在本試驗條件下，大鼠連續(xù)皮下注射甘精胰島素注射液9周，每天2次，能明顯降低IDDM模型動物GHb，對IDDM大鼠具有一定的治療作用。

連續(xù)給藥9周后，甘精胰島素注射液各劑量組和原研對照組動物的血清中BUN均值低于模型對照組，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；TG各劑量組均值均明顯低于模型對照組(P<0.05或P<0.01)，且具有一定的劑量相關性。各給藥組動物Cr和TC含量與模型對照組比較未見明顯變化(P>0.05)。具體結果詳見表3。

表3　皮下給藥期結束大鼠糖化血紅蛋白和主要血清生物化學指標比較

*P<0.05vsmodel-control group;**P<0.01vsmodel-control group； BUN：blood urea nitrogen; Cr：creatinine； TC：total cholesterol； TG：triglyceride； GHb：glycosylated hemoglobin.

3　討論

鏈脲佐菌素通過損傷胰腺β細胞使得胰島素的合成減少從而引發(fā)糖尿病[4-5]。β細胞受損程度與STZ劑量和給藥途徑相關[6]；另外，STZ的作用強度與動物種屬和性別有關，雄性大鼠較雌性大鼠更為敏感[7]。因此，本試驗結合受試藥物特點和預試驗結果，選擇雄性大鼠一次性靜脈注射鏈脲佐菌素58 mg/kg制備胰島素依賴型糖尿病動物模型，試驗結果顯示，該模型穩(wěn)定，為受試藥甘精胰島素注射液藥效學評價提供了較為理想的高血糖模型。

甘精胰島素注射液是一種新型的長效胰島素類似物，緩釋作用機制是通過DNA重組技術對人胰島素氨基酸序列進行結構修飾，改變了胰島素的等電點，當藥物注射到皮下組織后因pH發(fā)生改變而引起溶解度下降最后形成微細沉積物，該沉淀物可持續(xù)釋放少量的甘精胰島素，更大程度地延長了其吸收、分布時間[8-9]。本試驗結果顯示甘精胰島素的起效時間為1 h，2 h藥效作用最強，作用持續(xù)時間超過5 h，8 h后血糖基本恢復到給藥前水平。為更好的維持血糖平穩(wěn)，實驗期間給藥劑量和頻率進行了合理的調(diào)整，提示甘精胰島素在臨床應用時，應實施個體化治療，根據(jù)血糖控制情況，及時調(diào)整給藥劑量和頻率，使得血糖平穩(wěn)控制在基礎血糖范圍內(nèi)，同時避免夜間低血糖的發(fā)生。

糖、蛋白質及脂肪代謝紊亂是糖尿病的臨床綜合征，持續(xù)高血糖可引起機體多系統(tǒng)、多臟器功能損害衰竭等各種慢性合并癥。BUN是評價腎功能的指標之一；而TG過高會增加動脈粥樣硬化性心血管疾病的風險[10]。在糖尿病模型大鼠中，這兩個指標均異常升高；而經(jīng)甘精胰島素注射液治療后各劑量組的血清BUN和TG與模型對照組相比有了不同程度的降低(P<0.01)，表明甘精胰島素注射液能夠通過降血糖和降血脂等起到對腎臟的保護作用，從而有效減少糖尿病腎病和心血管疾病的發(fā)生率。

目前，空腹血糖檢查是一般臨床上診斷糖尿病的常用指標，但空腹血糖僅代表抽血時的瞬時血糖，受多種因素影響較大而出現(xiàn)漏診[11-12]。而GHb是由血液中葡萄糖的游離醛基與血紅蛋白的β鏈N末端纈氨酸的氨基進行不可逆的非酶促反應形成的，主要取決于血糖濃度及血糖與Hb的接觸時間[13-14]和紅細胞的壽命，不受測定時間、瞬時血糖水平等的影響[15]。2002年美國糖尿病協(xié)會明確規(guī)定應定期檢測GHb，并將其作為監(jiān)測糖尿病患者血糖控制情況的金指標[16-17]。本研究數(shù)據(jù)表明，甘精胰島素注射液各劑量組的糖化血紅蛋白較模型組有明顯降低(P<0.01)，說明糖尿病大鼠血糖控制良好，從而有效地降低了糖尿病所引起的合并癥。

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編輯孫超淵

， E-mail：zhangzp@tjipr.com

Antihyperglycemic effect of glargine injection in rat model of type 1 diabetes

Song Zihui△, Zhang Huixia△, Xiang Zongshang, Fan Mingyuan,Cai Yongming, Zhang Zongpeng*

(TianjinInstituteofPharmaceuticalResearchNewDrugEvaluationCompanyLimited,Tianjin300301,China)

ObjectiveTo evaluate the antihyperglycemic effect of glargine in streptozotocin (STZ)-induced type 1 diabetes in rats. MethodsHyperglycemic type 1 diabetic rats were obtained by intravenous injection of 2% STZ at the dose of 58 mg/kg and the success was adjudged by fasting glucose (≥16.7 mmol/L) within 3 consecutive days. Subsequently, 75 hyperglycemic rats were divided into five groups randomly and were treated with different doses of glargine, Lantus or control vehicle for 9 weeks, respectively. Meanwhile, a group consisted of 15 euglycemic rats was regarded as the control group and injected with control vehicle as well. Blood glucose levels, body weights, food intake and water intake in chow fed rats were measured weekly. Serum blood urea nitrogen (BUN), creatinine (Cr), total cholesterol (TC) and triglyceride (TG) were determined by automatic analyzer and glycosylated hemoglobin (GHb) was measured by rat glycosylated hemoglobin assay kits. ResultsCompared with model-control, an increase in body weight and a decrease in food intake were observed in rats treated with different doses of glargine. Also, glycemic levels in glargine group rats began to decline at 1 h post-injection, achieved minimally at 2 h and maintained for the following 8 hours. The reduction of GHb was dose-dependent and the decrease of serum concentration of BUN and TG was significant. ConclusionGlargine, consistent with Lantus, can lower the blood glucose in STZ-induced type 1 diabetic rats remarkably when injected twice daily with the dose of 4～8 IU/kg. It has the potent protection of kidney and regulation of blood lipid by decreasing serum concentration of BUN and TG, and could reduce the risk of diabetes complications by decreasing GHb level, as well.

streptozotocin (STZ); type 1 diabetes; glargine; glycosylated hemoglobin(GHb)

國家科技重大專項(2013ZX09302301)。This study was supported by National Science and Technology Major Project(2013ZX09302301).

時間：2016-10-1610∶55

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20161016.1055.008.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2016.05.018]

R 96

2016-02-03)

△共同第一作者