原代大鼠腦微血管內皮細胞培養方法的改進

徐平湘　齊　特　陸　莉　薛　明　肇玉明

(首都醫科大學基礎醫學院藥理系，北京 100069)

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， E-mail：yumingzhao@ccmu.edu.cn

· 技術與方法 ·

原代大鼠腦微血管內皮細胞培養方法的改進

徐平湘齊特陸莉薛明肇玉明*

(首都醫科大學基礎醫學院藥理系，北京 100069)

血腦脊液屏障(blood brain barrier，BBB)是機體的內部屏障之一，由介于血循環與腦實質間的軟腦膜、脈絡叢的腦毛細血管壁和包于壁外的膠質膜所組成，是中樞神經系統的重要解剖結構基礎[1]。血腦脊液屏障主要是由腦微血管內皮細胞(brain microvascular endothelial cells，BMECs)和周細胞構成，星形膠質足突包繞毛細血管的外周，覆蓋其95%～99%的表面積。其中，血管內皮細胞是構成血腦脊液屏障的關鍵組織細胞位點，存在結構復雜的緊密連接，且相對缺乏胞飲囊泡及窗孔，其能夠阻止大多數內外源性物質透過血腦脊液屏障，BBB的通透性是藥物分子發揮其中樞活性的決定性因素之一。藥物是否能夠在BBB上進行有效轉運是藥物進入腦組織和治療腦部疾病的主要制約因素[2]。

內皮細胞在血腦脊液屏障中的重要性決定了其是構建藥代動力學血腦脊液屏障體外藥物評價模型時的關鍵因素[3]。目前，國內外BBB模型多采用腦微血管內皮細胞與星形膠質細胞共培養建立。因此，內皮細胞培養技術與方法是構建該模型的關鍵因素之一。目前國內外關于BMECs的分離方法有篩網法、酶消化法及組織塊法等[4-6]，在提取的過程中常常需要Percoll梯度離心法，方法繁瑣，而且由于Percoll液為無機溶液，會對內皮細胞造成損害，影響細胞的活性。同時，從組織中提取微血管段后，培養的包被劑也會對細胞的活性及形態產生影響。因此，BMECs在組織分離、提取及接種的過程中還有優化和改進的必要性。本實驗室人員結合國內外報道[4-6]，在已有方法的基礎上，在組織分離過程中采用3種酶聯合消化法(膠原酶Ⅱ型、膠原酶/分散酶及DNA酶Ⅰ)，提取過程中利用差速離心替代Percoll梯度離心，采用內皮細胞專用培養液(endothelial cell medium，ECM)，對培養方法進行優化。并對比了鼠尾膠原與多聚賴氨酸作為包被劑下細胞的形態，為藥代動力學血腦脊液屏障模型提供細胞平臺。

1　材料與方法

1.1實驗動物

12只雄性SD大鼠，鼠齡16 d，中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXK-(軍)2012-0004。

1.2藥品與試劑

牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)購自美國Amresco公司，ECM、內皮細胞生長添加劑(endothelial cell growth supplement, ECGS)、青霉素/鏈霉素混合液和胎牛血清均購自美國Sciencell公司，DMEM培養基及其他培養試劑購自美國Invitrogen公司。膠原酶Ⅱ型購自美國Gibico公司，膠原酶/分散酶及DNA酶Ⅰ(DNAse Ⅰ)購自美國Roche公司，0.2%(質量分數)鼠尾膠原由本實驗室自行提取。 0.1%(質量分數)多聚賴氨酸(poly-L-lysine，相對分子質量70 000～150 000)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽 [3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide, MTT] 購自美國Sigma公司。 CD31(PECAM-1)抗體購自美國Millipore公司(稀釋比例 1∶250)，vWF抗體購自美國Santa Cruz公司(稀釋比例1∶100)， Alexa Fluor 594山羊抗兔IgG (稀釋比例 1∶200)購自美國Invitrogen公司，Alexa Fluor 488標記抗小鼠IgG(稀釋比例1∶200)、封閉用羊血清及免疫組織化學染色所用其他試劑均購自北京中山金橋生物技術有限公司。

1.3常用儀器

高性能無菌實驗臺(北京東聯哈爾儀器制造有限公司)，CO2恒溫培養箱和便攜式液氮生物容器(美國Thermo Fisher公司)，高壓消毒鍋(日本SANYO公司)，熒光顯微鏡Eclipse 80i(日本尼康公司)。

1.4細胞培養液的配制

ECM完全培養基：按照培養基說明書，配制含5%(體積分數)胎牛血清、1%(質量分數)青霉素/鏈霉素混合液和1%(體積分數)ECGS液的專業內皮細胞ECM完全培養基。

普通DMEM完全培養基：按照文獻[5]報道方法，配制含20%(體積分數)胎牛血清，2 ng/mL 成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、100 μg/L肝素鈉和1%(質量分數) 青霉素/鏈霉素混合液的普通DMEM高糖培養基。

1.5鼠尾膠原制備

取大鼠尾1條,75%(體積分數)乙醇消毒,剖開取出中間的尾腱,泡在0.1%(體積分數)醋酸中，4 ℃放置，并不時振蕩，48 h后取上清，離心1 789(×g) 30 min,取上清,棄沉淀。分裝上清(鼠尾膠原)4 ℃保存，用時以滅菌蒸餾水1∶20稀釋。

1.6原代內皮細胞的分離、培養

1.6.1腦微血管段的分離

大鼠脫臼處死，無菌條件下剪開顱骨，將取出的大腦放入盛有冰冷磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)培養皿中，解剖去除間腦、海馬、白質、灰質等，僅余大腦皮質，隨后將大腦皮質在干燥的滅菌濾紙上滾動，粘除軟腦膜及腦膜大血管后，用PBS漂洗3次，用剪刀剪成1 mm3大小糜狀物，0.1%(質量分數)膠原酶Ⅱ型混勻后置于37 ℃孵箱中消化90 min，消化過程中每10 min晃動1次，以確保消化完全；常溫離心111.8(×g)，離心8 min，棄掉上清液；消化產物加入2倍體積的20%(質量分數)BSA輕柔吹打10次左右，4 ℃ 1 000(×g)離心20 min，棄去中上層神經組織及大血管，保留底部沉淀。沉淀聚集物中加入2 mL DMEM培養基輕柔吹打洗滌，常溫111.8(×g)離心5 min，棄掉上清液，加入0.1%(質量分數)膠原酶/分散酶2 mL和2 kU/mL DNAse酶Ⅰ 30 μL分散沉淀物。產物放入37 ℃孵箱中消化1 h，常溫55(×g)離心6 min，棄掉上清液。再次加入2 mL DMEM洗滌，輕柔吹打5次，常溫離心111.8(×g)5 min，棄掉上清液，加入20%(質量分數)血清白蛋白2 mL輕柔吹打10次，4 ℃ 1 000(×g)離心20 min，棄掉上清液，獲得微血管段。

1.6.2微血管段的純化

微血管段提取后，加入12 mL ECM完全培養基輕柔吹打10次，在2個未經包被處理的60 mm培養皿中差速培養1 h，之后接種在經過0.2%(質量分數)膠原包被的25 cm2培養瓶，培養5～6 d后，以1∶3傳代培養。

1.7原代內皮細胞鑒定

原代培養的內皮細胞及第三段培養的內皮細胞分別種植在經過膠原包被的玻璃片上，用0.01 mol/LPBS洗滌細胞3次，4% (質量分數)多聚甲醛室溫固定15 min，固定后的培養細胞用0.01 mol/L PBS洗滌3次，用內皮細胞的特異性標志物CD31及vWF抗體進行免疫熒光共染色鑒定內皮細胞。染色步驟如下：5%(體積分數)的山羊血清室溫封閉半小時，加入CD11b及vWF一抗混合液，4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次，加入Alexa Fluor 594及Alexa Fluor 488二抗混合液室溫孵育1 h，PBS洗滌3次；將玻片扣于預先滴有含DAPI的封片劑的載玻片上，封片。

1.8內皮細胞純度計算

在熒光顯微鏡下隨機取5個視野以100倍放大情況下觀察、拍照，鏡下計數CD31與vWF雙陽性細胞數和細胞總數。

1.9不同培養包被劑對培養的內皮細胞形態的影響

分別以0.2%(質量分數)膠原及0.1%(質量分數)多聚賴氨酸包被的25 cm2培養瓶，培養6 d，觀察內皮細胞的形態，比較包被劑對培養的內皮細胞形態的影響。

1.10DNA酶在實驗中的作用

在分離血管段的過程中，斷裂的DNA與破碎的細胞交雜在一起，形成難以吹打的細胞團塊，導致血管得率低下，影響血管段的提取及接種后內皮細胞從血管段爬出。目前文獻[6]報道的分離腦微血管內皮血管段的方法多為不加DNA酶的膠原酶Ⅱ型和膠原酶/分散酶的兩種酶消化方法。借鑒本團隊之前原代神經元培養方法[7]，本研究在分離過程中加入了DNA酶Ⅰ，以降解斷裂的DNA。同時，為了驗證DNA酶在組織取材中的作用，本實驗設定了不加DNA酶Ⅰ的處理組，對比觀察原代培養 6 d之后的2種處理下細胞形態的差異。

1.11內皮細胞在ECM培養基與在DMEM培養基中生長情況的比較

將第3代內皮細胞接種在96孔板內，每孔5×102個細胞，用ECM培養基與DMEM培養基對比培養，利用光學顯微鏡觀察形態學及MTT比色法觀察細胞增生情況。

1.12統計學方法

2　結果

2.1原代培養內皮細胞形態學動態觀察

經光學顯微鏡觀察發現，分離獲取的微血管段長短不一，表面光滑，折光性好，細胞呈現串珠樣(圖1A)；培養3 d后，在接種部位圍繞微血管長出細胞，微血管段呈現“蜈蚣樣”形態,細胞為短梭形(圖1B)；培養5 d時，細胞以接種部位為中心不斷增生形成聚體群，不同群落之間不重疊，呈現鋪路石樣(又稱為“漩渦樣”)形態(圖1C)。

2.2內皮細胞純度鑒定

利用CD31與vWF的抗體進行免疫熒光共染色(圖2)，計數鏡下雙陽性細胞數和細胞總數，計算陽性細胞率。原代(圖2A～2D)與第3代細胞(圖2E～2H)陽性率均>99%，證明培養細胞為內皮細胞。第3代細胞在形態上保留了內皮細胞的短梭形，細胞聚合呈現“鋪路石樣”或“漩渦樣”形態，表明經過傳代后保留了內皮的特性。

2.3不同培養包被劑對培養的內皮細胞形態的影響

分別以0.2%(質量分數)膠原及0.1%(質量分數)多聚賴氨酸包被的25 cm2的培養瓶，接種24 h(1d)時，2種包被基質均可支持內皮細胞生長，且形態區別不明顯(圖3A和3C)；細胞培養6 d后，膠原包被的內皮細胞呈現漩渦態(圖3B)，而多聚賴氨酸包被的培養瓶中細胞未見典型漩渦態(圖3D),表明膠原作為包被材料更有利于內皮細胞保持固有細胞形狀。

圖1　原代培養微血管內皮細胞的形態學變化

On day 1, micro-vessels(→)were in different length while BMECs accumulated in bead-like (A). On day 3, surrounding the seeding site, BMECs proliferated from the micro-vessels (→)as centipede-like (B). On day 5, BMECs formed the typical curved ‘paving stone’ (→)(C). Magnification: 100 fold； BMECs：brain microvascular endothelial cells.

圖2　利用CD31與vWF的抗體進行免疫熒光共染色鑒定內皮細胞純度

A-D:images of primary cultured BMECs; E-H: images of third passage of BMECs; A， E: vWF; B，F：CD31; C，G：DAPI； Magnification: 100 fold；BMECs：brain microvascular endothelial cells.

圖3　不同培養包被介質對內皮細胞形態的影響

Cells with the support of 0.2% collagen (upper panel) and 0.1% poly-l-lysine (lower panel), respectively. Morphology changes of BMECs on day 1 (A, C) and on day 6 (B, D). Magnification: 100 fold； BMECs：brain microvascular endothelial cells.

2.4DNA酶在實驗中的作用

本研究發現，不加DNA酶Ⅰ的處理組，提取的微血管段明顯少于經過DNA酶Ⅰ的處理組，并且在培養6 d后細胞排列紊亂，細胞最初接種位置部分細胞成團生長(圖4A)；而經過DNA酶Ⅰ的處理，細胞相對排列有序(圖4B)。證明在取材時候，DNA酶Ⅰ將斷裂的DNA分解，便于消化物的吹打，有利于血管段的提取及后期細胞爬出并有序生長。細胞消化后計數，未加DNA酶Ⅰ的兩種酶法，每個25 cm2的培養瓶可得到4.2×105個細胞，而經過DNA酶Ⅰ處理的細胞組可得到2.5×106個細胞，即經過DNA酶Ⅰ處理后細胞收率可提高至未處理的5.95倍，說明經過處理對培養方法的改進是有效的。

2.5內皮細胞在ECM培養基及DMEM培養基中生長情況的比較

如圖5所示，在2種培養基中培養的細胞，從第2天開始，生長速度與第1天相比差異均有統計學意義(P<0.01)。兩種培養基相比較，在DMEM普通培養基中，內皮細胞生長緩慢；在ECM培養基中，內皮細胞從第2天開始進入對數生長期，5天后達到增生高峰，且第5天時細胞融合度已經約為90%。并且與DMEM培養基相比，ECM培養基培養的細胞在第2天、第3天、第5天和第6天增生速度分別為在DMEM培養基中的1.82、1.96、2.36、2.32倍，差異有統計學意義(P<0.01)，說明作為內皮細胞的專用培養基，ECM培養基確實可顯著增強內皮細胞活性及增生能力。

圖4　DNAse Ⅰ在提取微血管段中的作用

Morphology changes of brain microvascular endothelial on day 6 with DNAse I (A) and with DNAse I treatment (B). Magnification: 100 fold.

圖5　內皮細胞在普通DMEM完全培養基和ECM完全培養基中的生長差異

3　討論

目前，國內外分離腦微血管段的方法主要為篩網法和兩次酶分步消化法。通過篩網法細胞得率較低，且勻漿過程對細胞損傷較大，接種后難以存活；兩次酶分步消化法所分離的細胞雖存活率和細胞得率都有所提高，但在血管段分離提取過程中，由于斷裂的DNA與破碎的組織、細胞容易形成團塊，一方面降低細胞的得率，另一方面接種后細胞容易成簇生長，影響細胞的狀態。本實驗室曾經根據文獻[4]報道，摸索過篩網法，發現細胞存活率僅為30%，并且微血管段提取過程中容易形成不易吹打的團塊，與文獻[5]報道的現象一致。因此，本研究借鑒本團隊原代神經元培養的經驗，在血管段分離過程中，加入DNA酶Ⅰ優化分離方法。結果表明，經過DNA酶Ⅰ處理的消化產物，不易成團，容易吹打，接種后細胞排列有序，證實DNA酶Ⅰ的優化是必須且切實可行的。

經典的原代培養方法是利用Percoll液分離血管段。而Percoll液是無機鹽溶液，這種方法會對血管段造成一定的損傷。本研究用差速貼壁法代替Percoll液，以完全培養基在未經包被的培養皿內，經過1 h的差速貼壁培養，利用血管段與成纖維及腦膜等雜細胞的貼壁速度與貼壁能力的不同，可達到雜細胞貼壁而血管段不貼壁的目的。并且差速培養過程對血管段并無損傷，之后轉為包被后的培養瓶內培養，可提高細胞活性與純度。

本研究使用了內皮細胞專用ECM培養基，此培養基含有內皮細胞培養所需的微量元素、氨基酸、生長因子等。同時，本研究所用的胎牛血清和青/鏈霉素均為該公司產品，用上述試劑按照說明書要求的比例配制的完全培養基為優化培養基，可保證內皮細胞的優勢生長。在預實驗中發現，如果用普通的DMEM培養基及胎牛血清配制的培養基，培養5 d時所得到的內皮細胞純度僅為80%，而用ECM培養基則可大于99%；同時，生長曲線表明，用ECM完全培養基比普通培養基條件下培養的細胞生長速度顯著增快，證明選用此培養基對方法的優化是必要的。

除了對培養方法的優化，本研究還比較了培養包被介質對細胞形態的影響。研究顯示，膠原作為支持介質，內皮細胞更容易形成典型的鋪路石樣及“漩渦樣”形態；而多聚賴氨酸生長的細胞相對雜亂，證實膠原更適合內皮的生長。

綜上所述，本研究以膠原為包被介質，3種酶聯合消化法(膠原酶Ⅱ型、膠原酶/分散酶及DNA酶Ⅰ)分離腦微血管段，利用差速貼壁法去除雜細胞并采用內皮細胞專用培養基的優化培養細胞的方法，可獲得高純度與高存活率細胞，為建立血腦脊液屏障模型提供了可靠有效的技術方法，為中樞系統的藥理毒理學研究和藥物評篩提供了技術支撐[8]。

[1]董小平，喻斌，金路，等. 血腦屏障細胞組成研究進展[J]. 中國實驗方劑學雜志，2012，18(8)：281-284.

[2]周宓，王志強. 跨血腦屏障藥物轉運的研究進展[J]. 生命科學研究，2009，4(13)：372-376.

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編輯孫超淵

國家自然科學基金(31570856，3157040726)，北京市自然科學基金(5152005)，北京市教育委員會科技計劃一般項目基金(KM201610025003)，首都醫科大學校長基金(2015JS13)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China(31570856，3157040726), Natural Science Foundation of Beijing (5152005), Scientific Research Project of Beijing Educational Committee(KM201610025003), Capital Medical University Principal Foundation(2015JS13).

時間：2016-10-1610∶55

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20161016.1055.018.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2016.05.026]

2016-05-20)