類風濕關節炎患者外周血濾泡輔助性T細胞的表達

祝　驥　董浙清　許穎齡　盧德趙?

·檢測診斷·

類風濕關節炎患者外周血濾泡輔助性T細胞的表達

祝驥董浙清許穎齡盧德趙?

目的 觀察新型CD4+T輔助細胞亞群-濾泡輔助性T細胞（Tfh）在類風濕關節炎（RA）患者中的表達，探究其在RA發病中的作用及機制。方法 采用流式細胞術（FCM）檢測RA患者和健康者外周血單個核細胞（PBMC）中Tfh細胞的比例，同時提取淋巴細胞RNA，用實時熒光定量PCR檢測Tfh的特異性轉錄因子Bcl-6，用ELISA檢測效應分子IL-21。結果 與對照組比較，RA患者Tfh細胞的比例明顯上調，其特異性轉錄因子Bcl-6和效應分子IL-21的表達水平均顯著上升。結論 Tfh細胞亞群的功能調節失常可能是RA的重要發病機制之一。

類風濕關節炎 濾泡輔助性T細胞 流式細胞術

類風濕關節炎（RA）是臨床常見的一種以關節滑膜慢性炎癥為特征的全身性自身免疫性疾病，其發病機制至今尚不完全清楚［1-2］。研究表明免疫功能異常是重要的致病因素。濾泡輔助性T細胞（Tfh）是最近發現的一種能夠輔助B細胞產生抗體反應的CD4+T細胞亞群。Tfh定位于生發中心，表面特異性標志為CD4+CXCR5+，其分化不僅由轉錄因子Bcl-6調控，且需要人IL-21、誘導性協同刺激分子、抗體親和力等多種因素參與［3］。Tfh中的任何相關因子表達異常，將引發多種自身免疫性疾病。本實驗擬通過對RA患者外周血Tfh細胞表型及相關轉錄因子和細胞因子的檢測，探討其與RA發病的關系。

1　臨床資料

1.1一般資料 選取2014年1月至2015年1月本院門診及病房的初次診斷未接受治療的類風濕性關節炎患者20例，其中男6例，女14例；年齡40～55歲，均符合2009年RA診斷標準。排除未明確診斷的患者、合并其他自身免疫性疾病、免疫缺陷病、急性感染和惡性腫瘤等患者。另選擇本院健康體檢者20例為對照組。兩組年齡分布、性別構成比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2流式細胞儀檢測外周血Tfh細胞占CD4+T細胞的比例 采集受檢者晨起空腹外周血2ml，置于EDTA抗凝真空采血管中，搖勻后在＜6h測試進行檢測。檢測方法：每管中加入100μl血液，并向試驗管中加入熒光抗體CXCR5（CD185）-PerCp及CD4-FITC，而在對照管加入同型對照抗體，輕輕搖勻；室溫下避光孵育30min，每管加1ml紅細胞裂解液，混勻后避光孵育10min，等紅細胞裂解后，于1500r/min離心5min，棄上清液。用2mlPBS液洗滌2次，1500r/min離心5min，加400μl PBS液重懸，制成單細胞懸液細胞，用流式細胞儀（BD公司FACSCanto Ⅱ）分析檢測，測定時各熒光通道均以相應同種型IgG染色細胞作陰性對照。

1.3熒光定量PCR法檢測Bcl-6 mRNA的表達 收集兩組外周血，采用Ficoll密度-梯度離心法分離外周血單個核細胞，用TRIZOL法提取標本總RNA，紫外分光光度法檢測產物OD260/OD280，確定其濃度及純度，1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。從Genebank查詢Bcl-6 mRNA的核苷酸序列，利用Primer5.0設計軟件設計引物，進行熒光定量PCR分析。1.4 血清IL-21檢測 本實驗采用雙抗體夾心ELISA法，操作方法按試劑盒說明書操作。

1.5統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件。以卡方測試檢驗數據正態性。屬于正態分布的數據，以（x±s）表示。以Levene's test檢測方差齊性，采用完全隨機設計，比較兩樣本均數，根據方差齊性，采用t檢驗或t'檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1正常人與RA患者外周血CD4+CXCR5+細胞百分率 RA組中CD4+CXCR5+細胞數量顯著增加（P＜0.01），表明濾泡輔助性T細胞與類風濕關節炎存在一定的相關性。見圖1。

圖1　外周血淋巴細胞中CD4+CXCR5+細胞百分率

2.2兩組外周血淋巴細胞Bcl-6 mRNA的表達 與正常組比較，RA患者外周血淋巴細胞中Bcl-6 mRNA顯著增加（P＜0.01）。見圖2。

圖2　外周血淋巴細胞中Bcl-6 mRNA的表達

2.3正常人與RA患者外周血IL-21的水平 RA患者外周血中細胞因子IL-21的水平為（328.2±51.11）pg/ml，顯著高于對照組（146.4±20.42）pg/ml（P＜0.01）。見圖3。

圖3　外周血淋巴細胞中IL-21的表達

3　討論

在類風濕關節炎患者血清中有較多異常表達的抗體如抗核周因子抗體（APF）、抗角蛋白抗體（AKA）、抗聚角蛋白微絲蛋白抗體（AFA）及抗環瓜氨酸肽抗體（CCP）等［2］，但這些異常抗體產生原因尚未明確。病理性自身抗體的產生多是B細胞正性應答的結果，這一過程離不開T細胞的輔助。

濾泡B輔助性T細胞作為負責輔助B細胞的T細胞亞群［3］，在輔助B細胞的體液免疫應答中起著關鍵性的作用。本資料結果表明，RA患者外周血淋巴細胞中Tfh細胞的比例明顯上調。Tfh細胞可持續表達CXCR5，在CXCRl3的趨化下遷移到B細胞濾泡并同時高表達ICOS、Bcl-6和PD-l，分泌IL-21，執行輔助B細胞的功能。Bcl-6是調控Tfh細胞的主要轉錄因子，Th細胞群中缺乏Bcl-6，將不再產生Tfh細胞相關表面標志。Tfh細胞能夠大量分泌細胞因子IL-21，其不僅在B細胞分化為成熟的漿細胞過程中起重要作用，且還對其自身的分化有重要的誘導作用。此外，Tfh細胞表面存在IL-21受體，可與游離的IL-21結合，為Tfh細胞自身分化提供信號［3］。抵制IL-21的表達可以導致Tfh細胞功能異常，從而使B細胞數量減少、巨細胞（GC）形成障礙。在IL-21基因敲除的小鼠中，還發現CD4+T細胞表面CXCR5表達下降，Tfh細胞數量減少［4-6］。

本資料結果顯示Bcl-6和IL-21的表達水平均顯著增加。表明Tfh細胞的比例增加，可促進TI-21的產生，并可以刺激B細胞活化［7］，此外，TI-21還可能與其它炎性因子如TGF-β等的協同作用，最終導致機體分泌病理性自身抗體，從而誘發炎性反應。因此，Tfh細胞亞群的功能調節失常可能是RA的重要發病機制之一。

［1］ Humphreys JH，Verstappen SM. Etude et Suivi: Rheumatoid Arthritis in the 21st Century. J Rheumatol， 2013，40（10）:1637-1639.

［2］ Van WJ， Hazes JM，Visser H. Anticitr ullinated protein/peptide antibody and its role in the diagnosis and prognosis of early rheumatoid arthritis. Neth J Med，2002，60（10）: 383-388.

［3］ Vinuesa CG，Fagarasan S，Dong C. New territory for T follicular helper cells. Immunity，2013，39（3）:417-20.

［4］ Vogehang A， McGuire HM， Yu D， et al. A fundamental role for interleukin-21 in the generation of T follicular helper cells. Immunity， 2008， 29（1）:127-137.

［5］ Mc Heyzer LJ， McHeyzer MG. Antigen-spicific of B cell development. Annu Rev Immunol， 2005， 23:487-513.

［6］ Nurieva RI， ClmngY， Marinez GJ， et al.Bcl-6 mediates the development of T follicular helper cells，2009，325（5943）:100l-1005.

［7］ Hu YL，Matz DP，Chang J，et al.B7RP-l Blockade Ameliorates Autoimmunity through Regulation of Follicular Helper T Cells.J immunol，2009，182（3）:1421-1428.

Objective To identify the possible roles of a new CD4+T helper cell subset，T follicular helper cells（TFH），in the pathogenesis of Rheumatoid Arthritis. Methods The percentages of TFH cells in peripheral blood mononuclear cells （PBMCs） from patients with RA and healthy controls were assessed by fl ow cytometry（FCM）and then compared.Meanwhile，the expression of TFH transcription factors and cytokines，including Bcl-6 and IL-21 in lymphocytes，was also examined by real-time PCR and ELISA. Results In the patients of RA，the percentage of TFH cells was signifi cantly increased. So did the expression of Bcl-6 and IL-21，the typical transcriptional factor and cytokine of TFH. Our data suggest deregulation of TFH subset in the pathogenesis of RA. The underlying mechanisms remain to be determined. Conclusion Dysfunction of TFH cell subsets may be one of the important pathogenesis of RA.

Rheumatoid Arthritis T follicular helper cells Flow cytometry

浙江省中醫藥科技計劃（2013ZA066）；浙江中醫藥大學附屬第三醫院醫藥衛生科研計劃（ZS13CA01）

310005 浙江中醫藥大學附屬第三醫院檢驗科（祝驥董浙清）

310053 浙江中醫藥大學生命科學學院（許穎齡 盧德趙）