GeneXpert系統在肺結核中的診斷價值

范玲玲　李彩霞　黃黎俐　蔡曉平

GeneXpert系統在肺結核中的診斷價值

范玲玲李彩霞黃黎俐蔡曉平

目的 評價GeneXpert MTB/RIF系統在肺結核中的診斷價值。方法 對408例疑診肺結核的患者痰樣本分別進行痰抗酸鏡檢（AFB）、結核分枝桿菌培養（MTB）和GeneXpert MTB/RIF檢測，并進行比較。結果 以臨床確診為金標準，抗酸涂片鏡檢、TB培養和GeneXpert MTB/RIF檢測的敏感性分別為85.7%、99.0%、100%；以臨床確診+臨床診斷為金標準，抗酸涂片鏡檢、TB培養和GeneXpert MTB/RIF檢測的敏感性分別為38.0%%、43.9%、45.1%；GeneXpert敏感性高于抗酸涂片鏡檢（P＜0.05），等同于結核培養；GeneXpert菌量梯度與抗酸涂片鏡檢等級呈一定正相關（r=0.672）；GeneXpert利福平耐藥測定與傳統比例法藥敏測定具有明顯相關性（kappa=0.951）。結論 GeneXpert MTB/RIF系統在肺結核診斷、療效觀察及預后評估具有重要價值。

肺結核 利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術 抗酸染色 結核分枝桿菌培養

結核病實驗診斷是為結核病的確診提供病原學證據唯一手段，目前實驗室診斷主要依賴抗酸染色和TB培養等傳統方法，但抗酸涂片檢查存在檢出率低、無法區分結核與非結核分支桿菌等問題，TB培養亦存在污染率高、檢測時間長等缺點，致使部分結核患者無法及時準確診斷。世界衛生組織向全球結核病防治領域推薦利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術（GeneXpert Mtb/RIF，以下簡稱GeneXpert）分子生物學檢測方法，既能檢測結核病又能檢測耐利福平結核病，且能在＜2.5h獲得結果，明顯縮短結核病的檢測時間［1-3］。本文探討GeneXpert系統在肺結核中的診斷價值。

1　臨床資料

1.1一般資料 收集2014年7月至2015年12月本院感染科和呼吸科收治的疑診結核患者408例，其中男288例，女120例；年齡9～88歲，平均年齡（43.3±19.2）歲。納入標準：咳嗽、咯痰時間＞2周，因呼吸道癥狀接受檢查的初治結核病疑似患者，排除抗結核藥物治療患者。根據《WS 288-2008肺結核診斷標準》分為4類，分別為確診病例、臨床診斷病例、非結核病病例；在患者出院時仍無法明確診斷歸為無法診斷病例。

1.2儀器與試劑 GeneXpert檢測系統和檢測試劑盒購自美國Cepheid公司；酸性改良羅氏培養基由杭州創新生物檢控技術有限公司提供；抗酸染色液試劑由珠海貝索生物有限公司提供。

1.3方法 （1）抗酸涂片鏡檢：所有患者均取隨機痰標本進行涂片、抗酸染色、鏡檢，痰涂片檢查按《痰涂片鏡檢實驗室質量保證手冊》操作。（2）結核培養：每個患者痰涂片后剩余的樣本取1ml用40g/L的NaOH處理后接種至酸性羅氏培養基上，35℃孵育，每周觀察TB生長情況，連續觀察8周，無TB生長為培養陰性。（3）結核桿菌藥敏試驗：對結核分枝桿菌培養陽性者，挑取培養基上3周新鮮的菌落，采用比例法做藥敏試驗。菌液最終接種量為10-4mg和10-6mg，利福平在培養基內的最終濃度為40μg/ml。藥敏試驗按《結核分枝桿菌藥物敏感性試驗標準化操作程序及質量保證手冊》嚴格操作。（4）GeneXpea 系統檢驗：每個患者痰涂片后剩余的樣本取1ml進行 GeneXpert 系統檢驗，2.5h后觀察檢測結果。

1.4結果判定 （1）抗酸涂片染色鏡檢：根據AFB結果分為陰性、≤9條/300視野、+、++、+++、++++。（2）結核培養：根據羅氏培養基斜面菌落數占斜面面積多少，分為陰性、+、++、+++、++++。（3）GeneXpert系統檢測：MTB數量以MTB DNA拷貝的高低分為未檢出、極低、低、中、高5個量級。利福平檢測結果為敏感或耐藥。1.5 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件。數據采用配對χ2檢驗、等級相關檢驗和kappa檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1患者診斷情況 408例患者確診結核病105例（25.7%），臨床診斷結核病132例（32.4%），162例（39.7%）排除結核病，9例（2.2%）患者無法明確診斷。2.2 實驗室檢測結果 105例確診結核病患者的痰樣本中結核涂片和培養同時陽性89例，89例患者GeneXpert均陽性；結核培養陽性涂片陰性患者15例，15例患者GeneXpert均陽性；涂片陽性培養陰性1例，1例患者GeneXpert陽性；臨床診斷為肺結核的132例患者結核涂片、培養均陰性，GeneXpert陽性2例。162例臨床排除為結核的患者中有3例抗酸涂片和結核培養陽性，GeneXpert為陰性，細菌鑒定證實這三株細菌均為非結核分支桿菌。

2.3三種實驗室結果比較 408例患者以結核確診病例為金標準，結核患者105例，抗酸涂片鏡檢結果的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為85.7%、99.0%、96.7%、95.2%；結核培養結果的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為99.0%、99.0%、97.2%、99.7%；GeneXpert結果的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為100%、100%、100%、100%。GeneXpert的敏感性100%高于抗酸涂片的85.7%，差異有統計學意義（P＜0.05）；GeneXpe的敏感100%高于結核培養的99.0%，但差異無統計學意義（P＞0.05）。以結核確診病例+臨床診斷病例為金標準，結核患者237例，抗酸涂片鏡檢結果的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為38.0%、98.2%、96.8%、53.3%；結核培養結果的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為43.9%、98.2%、97.2%、55.8%；GeneXpert結果的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為45.1%、100%、100%、56.8%。GeneXpert的敏感性44.9%高于抗酸涂片的38.0%，差異有統計學意義（P＜0.05）；GeneXpert的敏感性45.1%高于結核培養44.9%，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.4GeneXpert量級與抗酸涂片鏡檢結果等級的比較 將107例GeneXpert陽性結果標本與其相對應的鏡檢結果進行Spearnman等級相關比較，可知涂片結果等級與GeneXpert 結果量級呈現一定的正相關趨勢（r=0.672，P＜0.05）。有17例涂片鏡檢結果為陰性而GeneXpert 量級為極低11例、低6例；6例鏡檢結果為高倍鏡視野＜9條/300個時，GeneXpert相對應的量級出現4例中、1例高2個量級；27例鏡檢結果為+時，GeneXpert相對應的量級出現13例低、14例中2個量級；40例鏡檢結果為++時，GeneXpert相對應的量級出現28例中、12例高2個量級；15例鏡檢結果為+++時，GeneXpert相對應的量級出現15例中1個量級；2例鏡檢結果為++++時，GeneXpert相對應的量級出現2例高1個量級。見圖1。

圖1　GeneXpert檢驗結果量級與抗酸涂片鏡檢量級的相互關系

2.5利福平耐藥的比較 GeneXpert檢測陽性的105例標本中，93例利福平敏感，12例利福平耐藥；與培養后的藥敏結果比較，其中92例敏感標本與金標準傳統藥敏方法完全符合，1例由于培養陰性未做藥敏而無法比較，12例利福平耐藥的標本，其中11例與傳統藥敏方法比較完全符合，另外1例GeneXpert結果為耐藥而傳統方法為敏感，一致率為99.0%（103/104），kappa值0.951＞0.75，表明2種方法檢測利福平藥敏結果具有較好的一致性。

3　討論

GeneXpert使用了半定量的巢式熒光定量PCR，在理論上GeneXpert能獲得較高的檢測靈敏度［4］。在本資料中，以臨床確診為金標準時，105例患者中GeneXpert系統可檢測出100%的陽性，其敏感度高于抗酸涂片鏡檢85.7%（P＜0.05），且特異性也達100%，高于抗酸涂片鏡檢99.0%；在以臨床確診+臨床診斷為金標準時，237例病例中GeneXpert系統可檢測出45.1%的陽性結果，其敏感度高于抗酸涂片鏡檢的38.0%（P＜0.05），且特異性也達到100%，高于抗酸涂片鏡檢98.2%。與結核培養比較，以臨床確診為金標準時，105例比較中GeneXpert系統可檢測出100%的陽性，其敏感度高于結核培養的99.0%，但差異無統計學意義；在以臨床確診+臨床診斷為金標準時，GeneXpert系統可檢測出45.1%的陽性結果高于結核培養的43.9%，但差異無統計學意義。表明GeneXpert檢測結核的敏感性高于抗酸涂片鏡檢，等同于甚至略高于結核培養。在162例排除為結核患者的標本中有3例患者結核培養和結核涂片均陽性，GeneXpert為陰性，菌株經鑒定為非結核分支桿菌。表明抗酸涂片無法區分結核和非結核分支桿菌，結核培養陽性需要經細菌鑒定才能明確。碰到抗酸涂片陽性標本而GeneXpert陰性時應懷疑非結核分支桿菌感染。

本資料中GeneXpert量級與抗酸鏡檢呈現正相關，但是相關關系一般，相關系數為0.672。當抗酸染色結果為陰性時，GeneXpert MTB/RIF系統也能檢測出陽性結果，甚至當抗酸涂片鏡檢結果為高倍鏡視野＜9條/300個時，GeneXpert相對應的量級可出現低、中、高三個量級。可能因為GeneXpert選取較多標本量且經預處理使菌量均勻分布，而抗酸涂片鏡檢制片時隨機挑取部分少量標本導致涂片的假陰性或涂片局部菌量分布不均。

GeneXpert系統能快速檢測出利福平耐藥株，而MTB培養和抗酸涂片鏡檢無法獲得其耐藥性的信息。GeneXpert針對rpoB基因81bp利福平耐藥核心區間（RRDR）設計引物、探針（A、B、C、D、E），檢測是否發生突變，進而診斷患者是否出現利福平耐藥［5-6］。本資料GeneXpert檢測耐利福平突變位點與傳統的結核藥敏的比例法一致性為99.0%（103/104），kappa值0.951＞0.75，表明兩種方法檢測利福平藥敏結果具有較好的一致性。但傳統的結核培養和結核藥敏耗時近8周，而GeneXpea系統可在2 h快速完成對利福平的敏感檢測，有利于結核病的早期治療。

綜上所述，GeneXpert 系統檢測結核具有快速簡單、操作自動化、敏感性、特異性高、結果準確、可半定量顯示標本帶菌量、可檢測利福平藥敏等優點，非常適合我國結核病的快速診斷和早期治療。

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Objective To evaluate the diagnostic value of GeneXpert MTB/RIF system in patients with pulmonary tuberculosis. Methods Total of 408 cases of sputum samples from the pulmonary tuberculosis and suspected pulmonary tuberculosis patients were collected，and tested by acid fast staining（AFB），Mycobacterium tuberculosis（MTB）culture and GeneXpert MTB/RIF system，the Results were compared. Results Clinical confi rmed diagnosis as gold standard，the susceptibility of acid fast staining 、TB culture and GeneXpert MTB/RIF was 85.7%%、99.0%、100% respectively；Clinical confi rmed diagnosis+Clinical diagnosis as gold standard，the sensitive was 38.0%、43.9%、45.1% respectively；the sensitivity of GeneXpert MTB/RIF was higher than acid fast staining（P＜0.05），equivalent to tuberculosis culture；GeneXpert MTB/RIF bacterial content gradient was positively correlated with acid fast staining（r=0.672）；GeneXpert determination of rifampin resistance and the proportion of drug sensitivity with good correlation（kappa=0.951）. Conclusion GeneXpertMTB/RIF system has important value in the diagnosis，assessment of curative effect and prognosis of pulmonary tuberculosis.

Pulmonary tuberculosis GeneXpertMTB/RIF Acid fast staining Mycobacterium tuberculosis culture

323000 浙江省麗水市人民醫院