Smad7基因質粒轉染骨髓間充質干細胞在體外對肝星狀細胞TGF-β1信號傳導的影響①

蘇冬娜　吳詩品

(深圳市人民醫院感染內科,深圳518020)

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Smad7基因質粒轉染骨髓間充質干細胞在體外對肝星狀細胞TGF-β1信號傳導的影響①

蘇冬娜吳詩品

(深圳市人民醫院感染內科,深圳518020)

目的：探討Smad7基因質粒轉染骨髓間充質干細胞(Smad7-EGFP-BMSCs)在體外抑制肝纖維化的機制。方法：分離、純化大鼠BMSCs并經Smad7基因腺病毒質粒(Ad-Smad7-EGFP)轉染建立Smad7-EGFP-BMSCs。實驗將大鼠肝星狀細胞HSC-T6分為A組、B組、C組和D組，分別與Smad7-EGFP-BMSCs、BMSCs、Smad7質粒及PBS進行共同培養72 h，采用ELISA測定培養液中Smad7和TGF-β1的表達，采用Western印跡法和RT-PCR法測定細胞Smad7、TGF-β1、Col Ⅰ、α-SMA蛋白和mRNA的表達，采用流式細胞術測定細胞凋亡情況。結果：(1)ELISA結果顯示，B組、C組和D組培養液TGF-β1蛋白水平較A組顯著降低(P<0.01)，而Smad7 蛋白水平較A組顯著升高(P<0.01)；D組TGF-β1 蛋白水平較B組和C組顯著降低(P<0.01)，而Smad7 蛋白水平較B組和C組顯著升高(P<0.01)；(2)Western印跡法和PCR結果顯示，B組、C組和D組TGF-β1、ColⅠ和α-SMA 蛋白和mRNA表達水平較A組顯著降低(P<0.01)，而Smad7 蛋白和mRNA表達水平較A組顯著升高(P<0.01)；D組TGF-β1、ColⅠ、α-SMA蛋白和mRNA表達水平較B組和C組顯著降低(P<0.01)，而Smad7 蛋白和mRNA表達水平較B組和C組顯著升高(P<0.01)；(3)流式細胞儀檢測結果顯示，B組、C組和D組HSC-T6細胞凋亡率較A組顯著升高(P<0.01)，而D組細胞凋亡率較B組和C組顯著升高(P<0.01)。結論：Smad7基因質粒轉染骨髓間充質干細胞可通過作用肝星狀細胞TGF-β1信號轉導通路以及促進星狀細胞凋亡而具有抗肝纖維化的作用。

Smad7；骨髓間充質干細胞；肝星狀細胞；TGF-β1信號通路；細胞凋亡

肝硬化是各種慢性肝病發展的晚期階段，具有發病率高、治療療效差及死亡率高的特點，我國是肝硬化的高發國家，研究肝硬化治療方法十分迫切。肝纖維化(Hepatic fibrosis，HF)是慢性肝病進展至肝硬化的重要階段，以細胞外基質(Extra cellular matrix，ECM)過度沉積為主要病理特征[1,2]。肝星狀細胞(Hepatic stellate cell，HSC)的激活是公認的肝纖維化形成中心環節[3]。肝星狀細胞通過產生和分泌大量膠原蛋白破壞肝基質代謝的平衡，由膠原蛋白組成的膠原纖維積聚在肝基質中，導致慢性肝病和肝癌等肝臟疾病的纖維化病變[4]。而轉化生長因子(Transforming growth factor-beta1，TGF-β1)通過其下游Smads等信號分子促進大鼠肝星狀細胞活化、增殖，從而在肝纖維化發生發展的進程中發揮重要作用[5,6]。而Smad7是TGF-β1信號轉導途徑的主要抑制性蛋白，是抗纖維化作用的重要信號分子。骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一種具有自我更新、多向分化潛能的多能干細胞，具有多種免疫調節能力，可促進肝細胞再生、轉分化為肝細胞和抑制肝纖維化，可部分恢復肝功能逆轉肝硬化，是除了肝移植手術外從根本上治療肝硬化的有效途徑[7]。本研究以體外培養的大鼠肝星狀細胞株HSC-T6為實驗對象，觀察Smad7基因質粒轉染BMSCs(Smad7-EGFP-BMSCs)對HSC-T6的作用，探討其是否可通過阻斷TGF-β1信號通路而具有靶向抗纖維化的作用。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物及細胞系Wistar大鼠，雄性，2周齡，體重30～40 g，由中山大學實驗動物中心提供，動物合格證號為SCXK(粵)2011-0029。肝星狀細胞系HSC-T6，為SV40轉染SD大鼠HSC，購自中國醫學科學院腫瘤細胞庫。

1.1.2主要試劑Smad7基因腺病毒質粒(Ad-Smad7-EGFP)和腺病毒質粒(Ad-eGFP)，由本實驗室構建；anti-CD29-PE、anti-CD34-FITC、anti-CD45-PE、anti-CD90-FITC、anti-RT1A-PE和anti-RT1B-FITC單克隆抗體，購自美國Dako公司；TRIZOL試劑、PrimeScriptTMRT reagent Kit及TaKaRa SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒，均購于TaKaRa公司，Smad7及β-actin抗體均購于Abcam公司；DMEM培養基、胰酶，購自美國Invitrogen公司；胎牛血清，購自北京索萊寶科技公司；細胞裂解液、ECL Prime 蛋白印跡試劑，購自美國Thermo公司；BCA蛋白定量試劑盒，購自美國Pierce公司；PVDF膜，購自美國Millipore公司；鼠抗人Smad7、TGF-β1、膠原蛋白Ⅰ(CollagenⅠ，ColⅠ)、α-肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)和β-actin一抗，購自美國CST公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗，購自北京中杉公司；大鼠Smad7、TGF-β1定量ELISA試劑盒，購自北京環亞泰克生物公司；細胞凋亡檢測試劑盒，購自南京凱基生物科技公司。

1.1.3主要試驗儀器恒溫細胞培養箱，購自美國Revco CO公司；Epics Altra流式細胞儀，購自美國Beckman Coulter公司；熒光倒置顯微鏡，購自日本Olympus公司；EXL808全自動酶標儀，購自美國Bio-Tek公司；ABI 7500 Real Time PCR System，購自美國ABI公司。

1.2實驗方法

1.2.1HSC細胞培養和傳代從液氮中取出HSC-T6細胞株迅速復蘇后轉入塑料培養瓶中(1×105個/ml)，用含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素混合液的DMEM培養基于5%CO2、37℃的恒溫培養箱培養。當細胞生長接近于鋪滿整個瓶底時，用含0.25%胰酶消化細胞，傳代，取第3代生長良好的細胞用于實驗。

1.2.2大鼠BMSCs的分離、純化和鑒定2周齡SD大鼠脫臼處死，于75%醫用酒精中浸泡10 min，在無菌條件下取脛骨和股骨，切除兩段骨骺，用DMEM培養液沖洗骨髓，制成單細胞懸液，采用貼壁法在DEMEM培養液中培養和純化。選取生長良好的第3代BMSCs進行實驗。將BMSCs分別加入Anti-CD29-PE、anti-CD34-FITC、anti-CD45-PE、anti-CD90-FITC、anti-RT1A-PE和anti-RT1B-FITC單克隆抗體，避光反應并洗滌后才有流式細胞儀檢測分析檢測細胞所標記的熒光長度以確定其表型和純度。體外間充質干細胞定向分化成骨細胞和脂肪細胞并鑒定。

1.2.3大鼠Smad7-EGFP-BMSCs的建立取第三代BMSCs，以1×106個/ml細胞濃度接種至培養板，待細胞融合率至70%時，每孔加入不同病毒感染復數(Multiplicity of Infection，MOI)的Ad-Smad7-eGFP(以Ad-eGFP和PBS作為對照)和Lipofecta-mine2000轉染試劑進行轉染，10 h后換液，48 h后加入新霉素進行篩選，熒光倒置顯微鏡檢測病毒的轉染率。以細胞內表達綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)表示感染成功。以感染效率高(>90%)、轉染值(MOI)低確定最佳感染條件。以Smad7慢病毒質粒在最佳條件進對BMSCs進行轉染，轉染成功后建立Smad7-EGFP-BMSCs基因工程干細胞，分別采用Western印跡法和PCR法測定Smad7蛋白和mRNA含量。

1.2.4Smad7-EGFP-BMSCs抗纖維化體外機制的研究取第三代處于對數生長期的HSC-T6細胞經0.25%胰酶消化，將細胞密度調整至1×106個/ml后接種于96孔板，實驗分為A組、B組、C組和D組，分別與Smad7-EGFP-BMSCs(1×104ml-1)、BMSCs(1×104ml-1)、Smad7質粒及同體積PBS進行培養。

1.2.4.1ELISA測定上清液Smad7和TGF-β1的表達每組設6個復孔，各組培養72 h后收集各組細胞上清液，采用ELISA法測定上清液Smad7、TGF-β1蛋白的表達。酶標包被板設置標準品孔、待測樣本孔和空白對照孔，分別加入標準品10 μl，待測樣本10 μl，37℃下孵化30 min，洗板，加入酶標工作液，洗板3次，分別加入顯色劑A 和B ，37℃避光顯色15 min，加入終止液以終止反應，立即采用酶標儀測定A值，計算樣本中Smad7和TGF-β1蛋白濃度。

1.2.4.2Western印跡法測定細胞Smad7、TGF-β1、Col Ⅰ 和α-SMA蛋白每組設6個復孔，培養72 h后收集HSC-T6細胞，采用細胞裂解液提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定各組Smad7、TGF-β1、Col Ⅰ 和α-SMA蛋白濃度。按蛋白量40 μg/孔進行10%SDS-PAGE凝膠電泳(80 V 20 min，150 V 約1.5 h)，轉膜(400 mA 2 h)至0.45 μm的PVDF膜，于5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入1∶1 000稀釋的一抗，4℃過夜，TBST緩沖液洗膜(5min×3次)，加1∶5 000稀釋的二抗，室溫孵育1 h，TBST緩沖液充分洗膜，應用ECL Prime 蛋白印跡試劑進行化學發光顯色，X片曝光顯影。用美國UVP公司Lab Works軟件對Western條帶進行定量分析，讀取積分光密度值。

1.2.4.3qRT-PCR法測定細胞Smad7、TGF-β1、ColⅠ和α-SMAmRNA每組6個復孔，培養72 h后收集HSC-T6細胞，加入TRIZOL裂解液裂解細胞后提取總RNA，酶標儀測定濃度及純度。應用TaKaRa逆轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit，嚴格按照說明書將提取的RNA逆轉錄為cDNA。根據NCBI-GenBank ColⅠ基因序列，利用Primer 5.0 軟件設計引物序列(見表1)。并應用TaKaRa SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒，進行PCR體系的擴增及反應。反應體系為50 μl： 10×PCR Buffer 5 μl，10 μmol/L dNTP 1 μl，模板1 μl，上游和下游引物各1 μl，0.5 μl 2 U/μl Taq DNA聚合酶(含Mg2+)，加入ddH2O至50 μl。PCR 反應條件為：94℃預變性5 min，94℃30 s，退火55℃ 45 s，72℃ 60 s，反應35個循環，72℃延展10 min。

表1引物序列及產物長度

Tab.1Primer sequences and product lengths

NamePrimersequencesProductlength(bp)Smad75'-TTCCTCCGCTGAAACAGGG-3'2205'-CCTCCCAGTATGCCACCAC-3'TGF-β15'-TGCTAATGGTGGACCGCAA-3'1125'-CACTGCTTCCCGAATGTCTG-3'Col-I5'-TACAGCACGCTTGTGGATG-3'2565'-TTGAGTTTGGGTTGTTGGTC-3'α-MSA5'-CTGTTCCGCCATCCTTCAT-3'1755'-CCGTGATCTCCTTCTGCATT-3'β-actin5'-CCGTGATCTCCTTCTGCATT-3'2685'-TGTGGACTTGGGAGAGGACT-3'

1.2.5細胞凋亡的測定每組設6個復孔，培養72 h后0.25%胰酶消化收集細胞，離心沉淀細胞，用預冷磷酸鹽緩沖液重懸細胞，調整細胞密度為1×105個/ml，采用細胞凋亡檢測試劑盒進行測定。取300 μl細胞懸液，加入5 μl膜聯蛋白V(Annexin V)-FITC、5 μl碘化丙啶(PI)標記，室溫避光反應5 min，采用流式細胞儀分析各組HSC-T6細胞的凋亡情況。綠色熒光FITC通道檢測Annexin V-FITC，紅色熒光通道檢測PI，每個標本測定10 000個細胞，測定速率為50～60個/min。

2　結果

2.1最佳轉染條件確認轉染48 h后在熒光倒置顯微鏡下可觀察到各組細胞均表達GFP。不同MOI(0、5、10、30、50、100)進行轉染HSC-T6細胞經培養，隨著MOI增加，HSC-T6細胞熒光表達增強，MOI=10時可見綠色熒光信號，但是MOI從10增至30時細胞生長抑制明顯加重，因而最佳MOI為10。HSC-T6細胞經Ad-Smad7-eGFP轉染成功后Smad7蛋白和mRNA表達水平顯著升高。

2.2各組培養液Smad7和TGF-β1的水平ELISA結果顯示，B組、C組和D組培養液TGF-β1蛋白水平較A組顯著降低(P<0.01)，而Smad7蛋白水平較A組顯著升高(P<0.01)；D組TGF-β1 蛋白水平較B組和C組顯著降低(P<0.01)，而Smad7蛋白水平較B組和C組顯著升高(P<0.01)，具體見表2。

表2各組培養液Smad7、TGF-β1水平的比較(n=6)

Tab.2Comparison of Smad7 and TGF-β1 in culture medium (n=6)

GroupsSmad7(ng/ml)TGF-β1(ng/ml)GroupA16.57±1.2426.73±1.85GroupB21.25±1.381)18.76±1.571)GroupC21.96±1.451)19.24±1.631)GroupD27.64±1.771)2)3)13.95±1.251)2)3)

Note：Compared with group A,1)P<0.01;compared with group B,2)P<0.01;compared with group C,3)P<0.01.

表3各組培養液Smad7、TGF-β1、ColⅠ和α-SMA蛋白表達水平的比較(n=6)

Tab.3Comparison of Smad7, TGF-β1, ColⅠ,and α-MSA in cultured cells (n=6)

GroupsSmad7TGF-β1ColⅠα-MSAGroupA0.52±0.071.24±0.110.86±0.071.43±0.10GroupB0.74±0.091)0.84±0.081)0.62±0.051)0.94±0.111)GroupC0.76±0.101)0.79±0.101)0.57±0.061)0.88±0.091)GroupD1.12±0.121)2)3)0.57±0.081)2)3)0.35±0.031)2)3)0.49±0.061)2)3)

Note：Compared with group A,1)P<0.01;compared with group B,2)P<0.01;compared with group C,3)P<0.01.

2.3各組細胞Smad7、TGF-β1、ColⅠ和α-SMA 蛋白的表達PCR結果顯示，B組、C組和D組TGF-β1、ColⅠ和α-SMA 蛋白表達水平較A組顯著降低(P<0.01)，而Smad7 蛋白表達水平較A組顯著升高(P<0.01)；D組TGF-β1、ColⅠ和α-SMA 蛋白表達水平較B組和C組顯著降低(P<0.01)，而Smad7 蛋白表達水平較B組和C組顯著升高(P<0.01)，具體見表3。

2.4各組細胞Smad7、TGF-β1、ColⅠ和α-SMA mRNA的表達PCR結果顯示，B組、C組和D組TGF-β1、ColⅠ和α-SMA mRNA表達水平較A組顯著降低(P<0.01)，而Smad7 mRNA表達水平較A組顯著升高(P<0.01)；D組TGF-β1、ColⅠ和α-SMA mRNA表達水平較B組和C組顯著降低(P<0.01)，而Smad7 mRNA表達水平較B組和C組顯著升高(P<0.01)，具體見表4。

2.5各組細胞凋亡情況的比較流式細胞術檢測結果顯示，B組、C組和D組HSC-T6細胞凋亡率較A組顯著升高(P<0.01)，而D組細胞凋亡率較B組和C組顯著降低(P<0.01)，具體見表5。

表4各組細胞Smad7、TGF-β1、ColⅠ和α-SMA mRNA表達水平的比較(n=6)

Tab.4Comparison of mRNA level of Smad7,TGF-β1,ColⅠ,and α-MSA in cultured cells (n=6)

GroupsSmad7TGF-β1ColⅠα-MSAGroupA0.36±0.041)0.98±0.081)0.82±0.081)1.18±0.101)GroupB0.52±0.041)0.74±0.061)0.59±0.061)0.68±0.071)GroupC0.49±0.051)0.69±0.051)0.55±0.071)0.73±0.101)GroupD0.84±0.081)2)3)0.51±0.061)2)3)0.31±0.041)2)3)0.36±0.051)2)3)

Note：Compared with group A,1)P<0.01;compared with group B,2)P<0.01;compared with group C,3)P<0.01.

表5Smad7-EGFP-BMSCs對HSC-T6細胞凋亡的影響(n=6)

Tab.5Impact of Smad7-EGFP-BMSCs on apoptosis of HSC-T6 cells (n=6)

GroupsSmad7GroupA1.87±0.541)GroupB4.83±0.731)GroupC5.22±0.851)GroupD9.48±1.481)2)3)

Note：Compared with group A, 1)P<0.01;compared with group B,2)P<0.01;compared with group C,3)P<0.01.

3　討論

肝硬化是一種以彌漫性纖維化的肝組織、再生結節和假小葉為特點的慢性疾病，機制至今尚不完全明確。肝纖維化是肝臟受到各種慢性損傷后的自我修復反應，主要表現為EMA的過量合成與沉積。目前普遍認為HSC 是肝臟分泌ECM的主要細胞，HSC 激活是肝纖維化形成的中心環節[8]。正常情況下肝星狀細胞處于靜息狀態，僅合成少量膠原。但是在肝臟疾病過程中，肝星狀細胞被激活，分泌大量ColⅠ形成EMA，并特異性表達α-SMA，同時ECM降解減少，最終導致肝纖維化[9]。HSC是肝纖維化基質中ColⅠ的主要來源[10]，因此抑制肝星狀細胞生成ColⅠ是抑制肝纖維化形成的關鍵環節[11,12]。

TGF-β1是目前發現的最強的促纖維化因子，它與細胞表面受體結合后可通過TGF-β1/Smads途徑傳遞活化信號，進而促進HSC表型轉變、增殖及ECM的合成[13]。Smads蛋白是唯一的TGF-β1受體后信使分子，TGF-β1通過其Ⅰ型和Ⅱ型受體完成信號轉導，以激活其下游Smads信號分子的磷酸化，隨后引起核轉位，進而調控基因的表達。Smads家族中Smad2～4、Smad6和Smad7參與TGF-β的信號轉導[14]，其中Smad7 是TGF-β1/Smad信號傳導途徑中重要的負性調節因子，可阻止Smad2、Smad3 的磷酸化，從而對TGF-β1/Smad信號通路發揮負性調控[15]。

BMSCs是一種具有自我更新、多向分化潛能的多能干細胞，可分化為多種骨骼及附屬器官組織，參與機體的多項功能調節[16]。最新研究表明，BMSCs是一種免疫特許細胞，自身不表達主要組織相容性復合體及其他共刺激分子，具有對自然殺傷細胞及細胞毒性T細胞的逃逸功能，在骨髓抑制的替代治療中有很大的應用前景[17]。有研究顯示通過靜脈注射或體外灌注BMSCs可以提高爆發性肝功能衰竭小鼠存活率[18]，另有研究顯示BMSCs可改善肝衰竭大鼠的免疫功能和肝臟組織炎性反應壞死狀態，促進肝功能的恢復[19]，但是其機制卻仍未有定論。

本研究結果顯示，Smad7-EGFP-BMSCs可降低HSC-T6細胞分泌TGF-β1蛋白水平(P<0.01)，而增加Smad7蛋白水平(P<0.01)；Smad7-EGFP-BMSCs可降低HSC-T6細胞表達TGF-β1、ColⅠ和α-SMA蛋白和mRNA水平(P<0.01)，而增加Smad7蛋白和mRNA水平(P<0.01)；Smad7-EGFP-BMSCske促進HSC-T6細胞凋亡(P<0.01)。并且Smad7-EGFP-BMSCs對HSC-T6細胞的上述作用較單獨BMSC或Smad7質粒作用更強，這可能與Smad7-EGFP-BMSCs同時發揮BMSCs和Smad7質粒作用因此抗肝纖維化作用更強有關。

總之，Smad7基因質粒轉染骨髓間充質干細胞可通過作用肝星狀細胞TGF-β1信號轉導通路以及促進肝星狀細胞凋亡而具有抗肝纖維化的作用。

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[收稿2015-12-03]

(編輯張曉舟)

Effect of Smad7 gene modified BMSCs to TGF-β signal conduction in hepatic stellate cells

SU Dong-Na,WU Shi-Pin.

Department of Infetious Disease,Shenzhen People′s Hospital,Shenzhen 518020,China

Objective:To investigate the mechanism of Smad7 gene modified bone marrow mesenchymal stem cells(Smad7-BMSCs)to prevent hepatic fibrosis in vitro.Methods: Smad7-EGFP-BMSCs were established by isolating and purifying BMSCs of rats,and transfecting Ad-Smad7-EGFP.HSC-T6 were divided into Group A,Group B,Group C and Group D,which were respectively incubated with Smad7-EGFP-BMSCs,BMSCs,Smad7 plasmid and PBS for 72 hours.The level of Smad7and TGF-β1protein in the culture solution was determined by ELISA.The expression of mRNA and protein of Smad7,TGF-β1,Col Ⅰ and α-SMA in the hepatic stellate cells were respectively determined by Western blot and RT-PCR.Cellular apoptosis was determined by flow cytometry.Results: (1)The results of ELISA showed that the level of TGF-β1 protein decreased(P<0.01) but the level of Smad7 protein increased (P<0.01) in Group B,Group C and Group D compared with Group A;the level of TGF-β1 protein decreased(P<0.01) but the level of Smad7 protein increased (P<0.01) in Group D compared with Group B and Group C.(2)The results of Western blot and RT-PCR showed that the level of mRNA and protein of Smad7,TGF-β1,Col Ⅰ and α-SMA decreased(P<0.01) but the level of mRNA and protein of Smad7 protein increased (P<0.01) in Group B,Group C and Group D compared with Group A;the level of mRNA and protein of Smad7,TGF-β1,Col Ⅰ and α-SMA decreased(P<0.01) but the level of mRNA and protein of Smad7 protein increased (P<0.01) in Group D compared with Group B and Group C.(3)The results of flow cytometry showed that the rate of cellular apoptosis decreased(P<0.01)，but the level of Smad7 protein increased (P<0.01) in Group B,Group C and Group D compared with Group A;the rate of cellular apoptosis decreased(P<0.01)in Group D compared with Group B and Group C.Conclusion: Smad7-BMSCs can have the effect of anti-hepatic fibrosis by affecting TGF-β1 signal pathway and promoting cellular apoptosis in hepatic stellate cells.

Smad7;BMSCs;Hepatic stellate cells;TGF-β1 signal pathway;Cellular apoptosis

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.007

蘇冬娜(1977年-)，女，碩士，主治醫師，主要從事病毒性肝炎的發病機制研究，E-mail:sudona@qq.com。

及指導教師：吳詩品(1963年-)，男，博士，主任醫師，主要從事肝硬化的干細胞治療研究。

R392

A

1000-484X(2016)10-1441-05

①本文為深圳市科創委立項課題(JCYJ20140416122812003)。