橋本氏甲狀腺炎患者外周血中CD4+CD45RO+記憶性T細胞的表達及意義

馬倩倩　梁秋華　孫　琳　張正軍　于世鵬

(濟寧醫學院，濟寧272067)

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橋本氏甲狀腺炎患者外周血中CD4+CD45RO+記憶性T細胞的表達及意義

馬倩倩梁秋華孫琳張正軍于世鵬①

(濟寧醫學院，濟寧272067)

目的：檢測初診橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto′s thyroiditis,HT)患者外周血CD4+CD45RO+記憶性T細胞比例，探討其在HT發病中的意義。方法：收集初診的HT患者作為病例組(HT,n=53)，另外選取年齡、性別相匹配的正常人作為對照組(HC,n=43)，并根據甲狀腺功能狀態將HT組分為甲狀腺功能正常組(HT-A,n=15)、亞臨床甲減組(HT-B,n=14)和臨床甲減組(HT-C,n=24)。流式細胞儀檢測外周靜脈血中CD4+CD45RO+記憶性T細胞比例，酶聯免疫吸附法檢測血清中IFN-γ、IL-17水平，化學發光法檢測甲狀腺功能及甲狀腺特異性抗體滴度。結果：HT組外周血中CD4+CD45RO+記憶性T細胞比例、IFN-γ、IL-17、TPOAb與TgAb水平均顯著高于HC組，P<0.01。雙變量相關分析顯示HT患者外周血CD4+CD45RO+記憶性T細胞的比例與IFN-γ、TPOAb、TgAb均呈正相關(P<0.01，P=0.015，P<0.01)。結論：CD4+CD45RO+記憶性T細胞在HT患者外周血中呈高表達，CD4+CD45RO+記憶性T細胞可能參與了HT的發病過程。

橋本氏甲狀腺炎;記憶性細胞;CD4+CD45RO+

橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto′s thyroiditis,HT)是典型的T細胞介導的器官特異性自身免疫性甲狀腺疾病[1]。在HT中，正常的甲狀腺腺體被淋巴細胞彌漫性浸潤，甲狀腺濾泡破壞并甲狀腺組織逐漸萎縮，伴有血清中甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)及甲狀腺球蛋白抗體(TgAb)等甲狀腺特異性抗體升高。

一般認為，遺傳和環境因素之間相互作用引起的機體免疫耐受的打破和自身反應性T細胞的激活是HT發病的關鍵，然而，其具體發生機制仍不明確。記憶性T細胞是初始T細胞在外周淋巴器官內接受抗原提呈細胞提呈的抗原后活化直接分化而成或由效應T細胞轉化而來。研究證實，記憶性T細胞與自身反應性T細胞可以相互轉化并參與了包括多發性硬化、系統性紅斑狼瘡等多種自身免疫性疾病的發生[1-4]，但其與HT的發病是否有關，尚無相關報道。本研究通過檢測HT患者與正常人外周血CD4+CD45RO+記憶性T細胞、IFN-γ、IL-17、TPOAb及TgAb的表達水平及其之間的相關性，旨在探究CD4+CD45RO+記憶性T細胞與HT發病的相關性，為研究HT的發病機制提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象2015年1月1日～2016年2月1日期間就診于濟寧醫學院附屬醫院的初診HT患者53名(女性51例，男性2例)，年齡(38.81±15.80)歲，且無確診的自身免疫性疾病、未服用過影響甲狀腺功能的藥物、未使用免疫抑制劑和糖皮質激素類藥物，排除各種原因引起的急慢性炎癥。選取43例 (女性42例，男性1例)、年齡(37.40±9.65歲)、性別與HT組相匹配的于濟寧醫學院附屬醫院體檢或者咨詢的正常人作為對照組。根據甲狀腺功能狀態將HT患者組分為甲狀腺功能正常 (HT-A，女性15例，男性1例)、亞臨床甲減組 (HT-B，女性14例，男性0例)和臨床甲減組 (HT-C，女性23例，男性1例)3個亞組。本研究獲得濟寧醫學院附屬醫院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署書面知情同意書。HT的診斷基于《內科學》第8版(人民衛生出版社)中HT的診斷標準[5]。

1.1.2主要儀器和試劑流式細胞儀型號為美國BD公司的FACS Calibur；FITC標記大鼠抗人CD4 IgG2a、PE標記大鼠抗人CD45RO IgG2b及其同型對照均購自美國e-Bioscience公司。IL-17細胞因子和IFN-γ細胞因子試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；酶標儀購自ThermoLabsystems公司。免疫分析儀型號為德國羅氏公司的Cobas6000。

1.2方法

1.2.1標本收集清晨空腹條件下抽取研究對象外周血2 ml×2管，其中1管送至檢驗科檢測甲狀腺功能狀態及甲狀腺相關特異性抗體，另1管1 000 r/min離心10 min后取上層血漿保存于-80℃冰箱，用于細胞因子的ELISA檢測，收集下層血細胞用于CD4+CD45RO+記憶性T細胞流式檢測。標本處理時間在采血后4 h以內完成。

1.2.2甲功及甲狀腺抗體的測定甲狀腺功能及甲狀腺特異性抗體均由濟寧醫學院附屬醫院檢驗科按照標準化流程應用化學發光法檢測。正常范圍如下:FT3(3.10～6.80 pmol/L)、FT4(12.0～22.0 pmol/L)、TSH(0.274～4.20 mU/L)、TPOAb(0～34 U/ml)、TgAb(0～110 U/ml)。

1.2.3流式細胞測定取50 ml全血應用流式細胞儀檢測CD4+CD45RO+記憶性T細胞。步驟如下:①對應標本編號進行試管編號，并按要求每一試管加入對應抗體及標本，渦旋混勻，避光孵育15 min；②加溶血素1.5 ml，渦旋混勻，避光孵育10 min，1 300 r/min離心5 min后去上清；③加PBS 1.5 ml渦旋混勻，1 300 r/min離心5 min后去上清，加PBS 0.5 ml，渦旋混勻；④上流式細胞儀檢測，用Cells Quest軟件獲取數據并進行分析。

1.2.4酶聯免疫吸附測定應用ELISA測定血清IFN-γ、IL-17水平，步驟如下:①確定所需抗體包被酶標板孔數目，增加2孔作為TMB空白顯色孔，將不同濃度標準品及已用樣品稀釋液稀釋的樣品100 μl加入，加封板膜，37℃反應90 min后洗滌；②每孔加入100 μl生物素抗人抗體工作液，加封板膜，37℃反應60 min后用洗滌；③每孔加入100 μl親和素-過氧化物酶抗體工作液(TMB空白顯色孔除外)，加封板膜，37℃反應30 min后洗滌；④每孔加入TMB顯色液90 μl，37℃避光反應30 min后觀察每孔顏色變為藍色的情況；⑤每孔加入TMB終止液100 ml，藍色變為黃色；⑥用酶標儀測定OD值；⑦將TMB空白顯色孔設為對照，做出曲線圖，找出各樣品對應濃度；⑧分析。

2　結果

2.1甲狀腺指標比較HT組血清TSH濃度、TPOAb與TgAb滴度均顯著高于HC組(P<0.01,P<0.01,P<0.01)，HT組血清FT4濃度顯著低于HC組(P<0.01)，血清FT3濃度與HC組無顯著差異(P=0.281)。見表1。

2.2外周血中CD4+CD45RO+記憶性T細胞比例HT組外周血CD4+CD45RO+記憶性T細胞比例(29.31±5.79)較HC組(21.03±3.06)顯著升高(P<0.01)，HT-A組(25.07±4.34)、HT-B組(30.09±3.80)和HT-C組(31.08±5.84)CD4+CD45RO+記憶性T細胞比例均顯著高于HC組(P=0.030,P<0.01,P<0.01)，HT-C組CD4+CD45RO+記憶性T細胞比例均顯著高于HT-A組(P=0.012)。見圖1、表2。

表1病例組與對照組的臨床資料

Tab.1Clinical information of patients with Hashimoto′s thyroiditis(HT) and healthy controls(HC)

ItermsCases(n)Gender(F/M)FT3(pmol/L)FT4(pmol/L)TSH(mU/L)TPOAb(U/ml)TgAb(U/ml)HT5351/24.57(3.60-5.10)11.66(8.45-13.931)8.64(2.76-38.64)1)449.80(325.30-600)1)466.70(298.20-1350.00)1)HT-A1515/14.79(4.16-5.29)14.20(13.30-17.35)2.08(1.20-2.60)378.90(266.95-600.00)1)368.90(292.45-540.65)1)HT-B1414/04.58(3.93-5.06)13.54(12.40-15.24)1)7.76(6.01-9.80)1)2)449.80(148.50-553.95)1)605.70(524.20-2919.50)1)2)HT-C2423/14.41(2.30-4.96)9.04(3.23-10.87)1)2)3)30.92(9.47-100.00)1)2)3)490.30(338.20-600.00)1)465.10(199.40-1968.00)1)HC4342/14.72(4.21-5.07)15.98(14.71-17.27)1.83(1.52-2.13)7.92(5.06-11.50)24.52(16.85-28.05)NR--3.10-6.8012.0-22.00.274-4.200-340-110

Note：vs HC,1)P<0.05;vs HT-A,2)P<0.05;vs HT-B,3)P<0.05；HT.Hashimoto′s Thyroiditis;HT-A.Euthyroid subset of Hashimoto′s thyroiditis;HT-B.Subclinical hypothyroidism of Hashimoto′s Thyroiditis;HT-C.Overt hypothyroidism subset of Hashimoto′s Thyroiditis;HC.Healthy control;FT3.Free triiodothyronine;FT4.Free thyroxine;THS.Thyroid-stimulating hormone;TPOAb.Thyroid peroxidaseantibody;TgAb.Thyroglobulin antibody;NR.Normal range.

圖1　CD4+CD45RO+記憶性T細胞流式細胞儀散點圖和箱式圖Fig.1　Scatter plots and box plots of flow cytometric analysis of CD4+CD45RO+memory T cellsNote: Percentages of CD4+CD45RO+memory T cells in PBMCs,was significantly higher than that in HC(P<0.01),percentages of CD4+CD45RO+memory T cells in PBMCs in HT-A,HT-B,HT-C,were all significantly higher than that in HC(P=0.030,P<0.01,P<0.01).

2.3血清中細胞因子水平ELISA結果HT組血清IFN-γ水平 (282.4±74.42)較HC組(188.46±38.08)顯著升高(P<0.01)，HT-A組 (243.03±32.24)、HT-B組(315.78±55.78)、HT-C組(294.35±87.89)血清IFN-γ水平均顯著高于HC組(P<0.01,P<0.01,P<0.01)，此外， HT-B組和HT-C組IFN-γ水平均顯著高于HT-A組(P<0.01,P=0.043)，HT-B組和HT-C組兩組間IFN-γ水平無顯著差異(P=0.622)。HT組血清IL-17水平[254.42(221.73～326.40)]較HC組[183.20(167.61～206.64)]顯著升高(P<0.01)，HT-A組[233.45(194.62～251.19)]、HT-B組[249.09(218.04～263.40)]和 HT-C 組[304.85(226.01～449.76)]血清IL-17水平較HC組顯著升高(P=0.018,P<0.01 ,P<0.01)，此外，HT-A組血清IL-17水平顯著低于HT-C組(P=0.012)。見表2。

表2HT組與對照組CD4+CD45RO+記憶性T細胞及細胞因子水平表達

Tab.2Expression of CD4+CD45RO+memory T cells and cytokines between Hashimoto′s Thyroiditis(HT)and Healthy Controls(HC)

ItermsCD4+CD45RO+memoryTcell(%)IFN-γ(pg/ml)IL-17(pg/ml)HT29.31±5.791)282.84±74.421)254.42(221.73-326.40)1)HT-A25.57±4.341)243.03±32.241)233.45(194.62-251.19)1)HT-B30.09±3.801)315.78±55.781)2)249.09(218.04-263.40)1)HT-C31.08±5.841)2)294.35±87.891)2)304.85(226.01-449.76)1)2)HC21.03±3.06188.46±38.08183.20(167.61-206.64)

Note：vs HC,1)P<0.05;vs HT-A,2)P<0.05;vs HT-B,3)P<0.05;IFN-γ.Interferon-γ；IL-17.Interleukin-17.

表3HT組外周血CD4+CD45RO+記憶性T細胞與細胞因子、甲狀腺特異性抗體相關性

Tab.3Correlation between CD4+CD45RO+memory T cells，cytokines and thyroid autoantibodies in Hashimoto′s thyroiditis(HT)

ItermsIFN-γIL-17TPOAbTgAbr0.7850.3540.4340.551P<0.010.051=0.015<0.01

2.4相關性分析應用雙變量相關性分析HT患者外周血中CD4+CD45RO+記憶性T細胞比例與血清IFN-γ、IL-17、甲狀腺相關指標之間的關系，結果顯示外周血CD4+CD45RO+記憶性T細胞比例與血清IFN-γ、TPOAb、TgAb均呈正相關(r=0.785,P<0.01;r=0.434,P=0.015;r=0.551,P<0.01),與血清IL-17、TSH無相關性(r=0.354,P=0.051;r=0.322,P=0.077)。見表3。

3　討論

生理條件下自身反應性T細胞處于非活化狀態，無致病作用，但在特定條件下活化、增殖、聚集，最終引發自身免疫性損傷。在外周血中，自身反應性T細胞在接觸抗原而被活化后，細胞膜表面的CD45RO表達增強，進一步增強免疫反應[6]。以往研究證實，自身反應性T細胞的異常激活與HT發病密切相關，參與HT的發病過程[7-9]。激活的自身反應性T細胞可與CD4+CD45RO+記憶性T細胞間相互轉化，反應過后的自身反應性T細胞大部分凋亡，少數轉化為CD4+CD45RO+記憶性T細胞，由初始T細胞轉化而來和效應T細胞轉化而來的CD4+CD45RO+記憶性T細胞則長期存在于機體內，當再次接受抗原刺激時即刻發生強烈的免疫反應，再次分化為激活的自身反應性T細胞，推測CD4+CD45RO+記憶性T細胞與自身反應性T細胞間的相互轉化可能與HT的發病有關。目前尚無CD4+CD45RO+記憶性T細胞與HT發病的相關報道。

本研究中，HT患者外周血單個核細胞中CD4+CD45RO+記憶性T細胞的比例顯著高于對照組。我們的結果提示CD4+CD45RO+記憶性T細胞可能參與了HT的發病。有學者研究發現CD4+CD45RO+記憶性T細胞可通過分泌IFN-γ、IL-17加重自身反應性T淋巴細胞的浸潤及加重局部炎癥反應發揮其生物學作用[10，11]。IFN-γ、IL-17是目前公認的在HT患者中升高且與病情嚴重程度相關的炎癥細胞因子[12，13]，我們的實驗亦證明HT患者血清中IFN-γ、IL-17水平較對照組升高。進一步的相關性分析發現，HT患者外周血中CD4+CD45RO+記憶性T細胞比例與IFN-γ水平呈明顯正相關，進一步提示CD4+CD45RO+記憶性T細胞可能與HT的發病相關，其可能通過產生IFN-γ等細胞因子作用于HT的發病過程，且通過檢測HT患者外周血CD4+CD45RO+記憶性T細胞的比例可以反應HT患者甲狀腺自身免疫性炎癥狀態從而提示病情變化趨勢。Taylor等[14]指出CD4+CD45RO+記憶性T細胞的T細胞受體可以更快的產生細胞因子mRNA，故可更加迅速地發揮作用。

除了淋巴細胞浸潤，HT的另一個重要特點為可檢測出高濃度的甲狀腺自身抗體如TPOAb、TgAb，有學者稱這兩種抗體表明甲狀腺自身免疫性損害的嚴重性[15,16]。95%的HT患者TPOAb陽性，且與甲狀腺自身反應性淋巴細胞浸潤的數量有很好的相關性，但是健康人中卻鮮有發現TPOAb陽性[17]，而且每年有4.3%TPOAb陽性的亞臨床患者進展為甲減，而TPOAb陰性的亞臨床患者只有2.6%進展為甲減，故TPOAb陽性被認為預示著AITD患者日后可發生甲狀腺功能減退[18]，大約90%的HT患者中可發現高滴度的TgAb[19]，但是它在誘發HT中的作用尚不清楚。本研究中，我們發現HT組中外周血CD4+CD45RO+記憶性T細胞與TPOAb、TgAb均呈顯著正相關，亦提示CD4+CD45RO+記憶性T淋巴細胞可能參與HT的發病，并且CD4+CD45RO+記憶性T細胞的升高可能有助于預測HT患者可能進展為甲減。

4　結論

總之，本研究顯示CD4+CD45RO+記憶性T細胞在HT患者中顯著升高，并與IFN-γ、TPOAb、TgAb的表達水平呈正相關，提示CD4+CD45RO+記憶性T細胞可能參與HT的發病過程。但是鑒于記憶性細胞和細胞因子在HT的發病過程中的多效性和網格性的特點，其具體機制仍需進一步探討。

[1]Pyzik A,Grywalska E,Matyjaszek-Matuszek B,etal.Immune disorders in hashimoto′s thyroiditis:what do we know so far?[J].J Immunol Res,2015:979167.

[2]向雅娟,何洋,劉廣志.多發性硬化記憶性T細胞亞群的免疫學研究進展[J].中華臨床醫師雜志(電子版),2014,8(8):1538-1542.

[3]Bossowski A,Moniuszko M,Idzkowska E,etal.Evaluation of CD4+CD161+CD196+and CD4+IL-17+Th17 cells in the peripheral blood of young patients with hashimoto′s thyroiditis and Graves′ disease[J].Pediatr Endocrinolo Diabetes Metab,2012,18(3):89-95.

[4]Bai X,Sun J,Wang W,etal.Increased differentiation of Th22 cells in Hashimoto′s thyroiditis[J].Endocr J,2014,61(12):1181-1190.

[5]葛均波,徐永健.內科學[M].第8版.北京:人民衛生出版社,2013:697-698.

[6]姜優,劉云啟,譚敏,等.自身免疫性腎炎模型中自身反應性細胞的克隆誘導及免疫學行為分析[J].中華腎臟病雜志,2003,19(2):99-103.

[7]鄭莉,陳紫君,劉純.Th3、Th17及相關細胞因子在自身免疫性甲狀腺疾病發病中的作用[J].臨床免疫學,2013,29(1):43-47.

[8]Guo H,Peng D,Wang Y,etal.A higher frequency of circulating IL-22(+)CD4(+) T cells in Chinese patients with newly diagnosed Hashimoto′s thyroiditis[J].PLoS One,2014,9(1):e84545.

[9]Glick AB,Wodzinski A,Fu P,etal.Impairment of regulatory T-Cell function in autoimmune thyroid disease[J].Thyroid,2013,23(7):871-878.

[10]Soudja SM,Chandrabos C,Yakob E,etal.Memory-T-cell-derived interferon-γ instructs potent innate cell activation for protective immunity[J].Immunity,2014,40(6):974-988.

[11]Hsu SC,Wang LT,Yao CL,etal.Mesenchymal stem cells promote neutrophil activation by inducing IL-17 production in CD4+CD45RO+T cells[J].Immunobiology,2013,218(1):90-95.

[12]Nanba T,Watanabe M,Inoue N,etal.Increases of theTh1/Th2 cell ratio in severe Hashimoto′s disease and in the proportion of Th17 cells in intractable Graves′ disease[J].Thyroid,2009,19(5):495-501.

[13]Xue H,Yang Y,Zhang Y,etal.Macrophage migration inhibitory factor interacting with Th17 cells may be involved in the pathogenesis of autoimmune damage in hashimoto′s thyroiditis[J].Mediators Inflamm,2015，2015:621072.

[14]Taylor JJ,Jenkins MK.CD4+memory T cell survival[J].Curr Opin Immunol,2011,23(3):319-323.

[15]Caturegli P,Chuang K,Dembele M,etal.Hashimoto′s thyroiditis:celebrating the centennial through the lens of the Johns Hopkins hospital surgical pathology records[J].Thyroid,2013,23(2):142-150.

[16]錢偉,杜婷婷,吳漢妮.基于IgG4分類的橋本甲狀腺炎臨床意義探討[J].中國免疫學雜志,2015,31(5):686-689.

[17]Pandit AA,Warde MV,Menon PS.Correlation of number of intrathyroid lymphocytes with antimicrosomal antibody titer inHashimoto′s thyroiditis[J].Diagn Cytopathol,2003,28(2):63-65.

[18]Antonelli A,Ferrari SM,Corrado A,etal.Autoimmune thyroid disorders[J].Autoimmun Rev,2015,14(2):174-180.

[19]Liu M,Zhao L,Gao Y,etal.Epitope recognition patterns of thyroglobulin antibody in sera from patients with Hashimoto′s thyroiditis on different thyroid functional status[J].Clin Exp Immunol,2012,170(3):283-290.

[收稿2016-01-07修回2016-03-16]

(編輯許四平)

Expression and significance of CD4+CD45RO+memory T cell in peripheral blood of patients with Hashimoto′s thyroiditis

MA Qian-Qian，LIANG Qiu-Hua，SUN Lin，ZHANG Zheng-Jun，YU Shi-Peng.

Jining Medical University,Jining 272067,China

Objective:To explore the role CD4+CD45RO+memory T cells in the pathogenesis of Hashimoto′s thyroiditis (HT) by detecting the percentages of CD4+CD45RO+memory T cells in peripheral blood mononuclear cells in peripheral blood of newly diagnosed HT patients.Methods: 53HT patients and 43 matched healthy controls (HC) were included in this study.According to the thyroid functions,HT patients were divided into euthyroid subset(HT-A,n =15) ,subclinical hypothyroidism(HT-B,n=14) and overt hypothyroidism subset (HT-C,n=24).The percentages of CD4+CD45RO+memory T cells in PBMCs,as well as the level of serum IFN-γ and IL-17,and thyroid functions,and the titers of thyroid-specific autoantibodies (TPOAb,TgAb) were respectively detected by flow cytometry,ELISA,and ECLIA.Results: The percentages of CD4+CD45RO+memory T cells in PBMCs,as well as the level of serum IFN-γ and IL-17,the titers of TPOAb，TgAb were all significantly higher than that in HC(P<0.01).Bivariate correlation revealed that the percentages of CD4+CD45RO+memory T cells positively correlated with the level of serum IFN-γ,TPOAb and TgAb(P<0.01，P=0.015，P<0.01) in HT patients.Conclusion: The significant increase of CD4+CD45RO+memory T cells in peripheral blood of patients with HT suggested a role of CD4+CD45RO+memory T cells in the pathogenesis of this disease.

Hashimoto′s thyroiditis;Memory T cell;CD4+CD45RO+

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.025

馬倩倩(1989年-) ，女，碩士，主要從事內分泌與代謝病的研究，E-mail: MXQ-qianqian@163.com。

及指導教師：于世鵬(1963年-)，男，教授，碩士生導師，主要從事甲狀腺疾病方面的研究，E-mail: yushipengjn@163.com。

R581.4

A

1000-484X(2016)10-1527-05

①濟寧醫學院附屬醫院兗州院區，濟寧272100。