MPO-ANCA相關性血管炎中抗溶酶體相關膜蛋白-2抗體的作用初探

桂雅迪，帥宗文，胡子盈，張銘明，武琳琳，陳珊宇

MPO-ANCA相關性血管炎中抗溶酶體相關膜蛋白-2抗體的作用初探

桂雅迪，帥宗文，胡子盈，張銘明，武琳琳，陳珊宇

目的 初步探討抗溶酶體相關膜蛋白-2抗體（LAMP-2A）在髓過氧化物酶抗中性粒細胞胞質抗體相關性血管炎（MPO-AAV）中的存在及意義。方法 采用ELISA法分別檢測入選者周圍血的LAMP-2A、髓過氧化物酶抗中性粒細胞胞質抗體（MPO-ANCA）、溶酶體相關膜蛋白-2（LAMP-2）、髓過氧化物酶（MPO）及活化補體C5a水平，比較LAMP-2A陽性與陰性患者間臨床資料及上述指標間的差別，并分析其相關性。結果 MPO-AAV患者中LAMP-2A的陽性率為48.44%，陽性率在有無腎、肺損害患者中差異無統計學意義；病例組LAMP-2水平顯著高于對照組（P＜0.001）；LAMP-2A陽性患者C5a、MPO及LAMP-2水平顯著高于陰性患者（P＜0.01），并且LAMP-2A分別與C5a、MPO及LAMP-2水平呈顯著正相關性（rs=0.056、0.525、0.723，P＜0.001），與MPO-ANCA及BVAS無明顯相關性。結論 MPO-AAV中自身抗體LAMP-2A常見，其獨立于自身抗體MPO-ANCA，可能通過促進補體旁路激活、結合升高的自身抗原（LAMP-2）等途徑影響MPO-AAV的臨床損害，更確切的作用和意義有待進一步探討。

ANCA相關性血管炎；髓過氧化物酶；抗溶酶體相關膜蛋白-2抗體；溶酶體相關膜蛋白-2；補體激活；致病機制

我國AAV主要以抗髓過氧化物酶中性粒細胞胞質抗體（myeloperoxidase-antineutrophil cytoplasmic antibody，MPO-ANCA）陽性為特征的MPO-ANCA相關性血管炎（MPO-ANCA associated vasculitis，MPOAAV）為主，臨床并不少見，其病情多進展迅速，常累及多系統，誤診率及病死率高［1］。目前認為MPO-ANCA是MPO-AAV的致病性抗體，但至今尚沒有成功使用MPO或MPO-ANCA誘導AAV肺損害的動物模型，且有研究［2］顯示，患者MPO-ANCA的水平與伯明翰血管炎活動度評分（Birmingham vasculitis activity score，BVAS）間并無肯定的相關性，推測MPO-AAV患者體內可能有其他因素參與其發病和臨床損害。Kain et al［3］首先在AAV腎炎患者中發現抗溶酶體相關膜蛋白-2抗體（anti-lysosome-associatedmembraneprotein-2antibodies，LAMP-2A），陽性率超過80%，并成功建立了AAV腎臟損害的動物模型［4］。但研究［5］顯示僅21%的AAV患者LAMP-2A陽性，且未發現LAMP-2A在大鼠腎小球沉積及LAMP-2A導致大鼠腎小球腎炎的發生。因此，LAMP-2A在AAV中的作用目前尚存在爭議。至目前尚未見LAMP-2A在MPO-AAV中的研究報道，該研究初步探討MPO-AAV患者中LAMP-2A的存在情況以及其與MPO-ANCA、補體旁路激活及MPO-AAV活動的關系，從更廣泛的角度初步探討MPO-AAV的臨床發病和損害機制。

1 材料與方法

1.1 病例資料 選取安徽醫科大學第一附屬醫院2012年1月～2015年3月住院AAV患者128例。首先間接免疫熒光法（indirect immunofluorescence，IIF）篩檢每例患者p-ANCA（+），再用ELISA法定量檢測MPO-ANCA水平。患者臨床表現均符合美國風濕病學院GPA和EGPA的分類標準及2012年Chapel Hill共識會議（Chapel Hill Consensus Conference，CHCC）關于MPA、GPA或EGPA的分類標準［6］。為避免PR3-ANCA及ANA對研究的影響，排除PR3-ACNA（+）或ANA（+）的患者，并排除確診為其他結締組織病者。128例患者（病例組）中，男∶女=51∶77，年齡18～90（63.27±15.14）歲，病程2（0.5，60）個月，均為初診未治療的MPO-AAV患者，其中MPA 125例，GPA 2例，EGPA 1例，病情均處于活動期，BVAS 2～29（16.26±6.91）分。另于我院體檢中心隨機選擇30例健康人作為正常對照組，男∶女=12∶18，年齡47～79（60.73±8.76）歲。收集每例患者的詳細臨床資料，采用BVAS評估病情活動性，采集周圍靜脈血并分離血清于-80℃凍存。本研究方案通過安徽醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 ACNA及ANA檢測 以酒精固定的人中性粒細胞和Hep-2細胞為底物（歐蒙醫學實驗診斷股份有限公司試劑盒），IIF法檢分別篩檢外周血ANCA和ANA，篩選僅p-ANCA陽性的患者，剔除c-ANCA或ANA陽性者。

1.2.2 MPO-ANCA檢測 采用ELISA方法定量檢測患者血清MPO-ACNA水平。96孔酶標板中每孔包被人MPO抗原（美國Sigma公司）2 μg，1∶100稀釋的患者或正常對照血清為一抗，抗堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）標記的羊抗人IgG（美國Sigma公司）經1∶5 000稀釋為二抗，其余實驗步驟同常規ELISA。取正常對照組吸光度（absorbance，A）值的+2s為正常值上限，高于正常值上限為陽性，除外ELISA檢測MPO-ANCA陰性患者。

1.2.3 LAMP-2A、LAMP-2、C5a、MPO檢測 采用ELISA方法（美國TSZ公司試劑盒），按照各試劑盒說明書操作步驟檢測患者及正常對照組外周血LAMP-2A、LAMP-2、C5a、MPO水平。LAMP-2A的檢測和結果判定方法同MPO-ANCA，取正常對照組所測指標A值的+2s為正常值上限，高于正常上限值為陽性。

1.3 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行分析，計量資料用±s表示，2組樣本間比較采用經Welch校正的非配對t檢驗。計數資料用四分位數表示，2組樣本間比較采用χ2及秩和檢驗分析。相關分析采用Spearman等級相關分析。

2 結果

2.1 病例組血清LAMP-2A的陽性率及LAMP-2水平變化 病例組與健康對照組間性別構成（χ2= 0.000，P=0.987）及年齡比較（t=1.218，P= 0.227）差異無統計學意義。以健康對照組LAMP-2A的ELISA檢測A值的+2s為正常值上限，檢測病例組LAMP-2A的陽性率為48.44%（62/128）。128例患者中70.31%（90/128）合并有腎損害，67.19%（86/128）合并有肺損害，有、無肺/腎損害患者間LAMP-2A陽性率比較見表1，結果顯示差異無統計學意義。病例組血清LAMP-2水平顯著高于正常對照組，差異有統計學意義［0.142（0.102，0.238）vs 0.082（0.063，0.106），Z=-5.112，P＜0.001］。

表1 有、無腎/肺損害患者中LAMP-2A的陽性率比較（n）

2.2 LAMP-2A陽性與陰性患者間部分臨床指標的比較 將62例LAMP-2A陽性與66例陰性患者各設為一組，比較2組間部分臨床指標，顯示兩組間性別構成、年齡、病程、BVAS及MPO-ANCA水平比較差異無統計學意義，但2組間血清C5a、MPO及LAMP-2水平比較差異有統計學意義，LAMP-2A陽性組顯著高于陰性組，見表2。

2.3 LAMP-2A與部分臨床指標的相關性分析

將62例LAMP-2A陽性患者的LAMP-2A水平分別與MPO-ANCA、MPO、C5a及LAMP-2及BVAS作相關分析，顯示LAMP-2A分別與MPO、C5a及LAMP-2呈顯著正相關性（rs=0.525、0.056、0.723，P＜0.001）。與MPO-ANCA及BVAS無明顯相關性（rs=-0.209，P=0.285；rs=-0.081，P=0.530）。

表2 LAMP-2A陽性與陰性患者間臨床資料及觀察指標的比較

3 討論

Kain et al［3］最早在AAV患者中發現抗LAMP-2抗體的陽性率是87%。隨后的兩次研究中，該抗體的陽性率均在80%以上［4，7］。然而，Roth et al［5］在AAV患者中測得該抗體的陽性率僅為21%。本研究顯示MPO-AAV患者中LAMP-2A的陽性率為48.44%，除種族差異外，分析此陽性率的差異可能與AAV疾病的構成及治療的影響有關。本研究選擇的病例符合中國AAV以MPO-ANCA陽性MPOAAV為主的特點，為除外治療對觀察指標的可能影響，入選病例均為未經治療的初診病例，而Kain et al［3-4，7］選擇的病例包括MPO-AAV和PR3-AAV，均為經病理證實的ANCA相關性寡免疫復合物型局灶性壞死性腎小球腎炎（pauci-immune focal necrotizing glomerulonephritis，FNGN），且病情處于活動期，部分患者經免疫抑制劑治療病情緩解后LAMP-2A消失，認為該抗體與疾病活動度相關。Roth et al［5］選擇的AAV病例也經病理證實為寡免疫腎小球腎炎，但44.12%的入選病例病情處于緩解期（BVAS=0），結果未顯示該抗體與AAV病情活動性之間存在顯著相關性。上述研究均以探索寡免疫腎小球腎炎發病機制為目的，選擇的患者均強調其有腎臟損害，而AAV中腎和肺均為最常見的損害器官［1］，本研究比較并發腎、肺損害患者LAMP-2A的陽性率，顯示差異無統計學意義，提示在AAV中，LAMP-2A并非特異存在于腎損害的患者。

近年來，動物實驗［8］與臨床研究［9-10］顯示補體旁路途徑激活在AAV中發揮重要作用，阻斷補體旁路途徑激活的C5a可以阻止AAV的發病［11-12］，前期研究［13］也顯示MPO-AAV患者周圍血中C5a水平明顯升高，而升高的C5a水平可趨化中性粒細胞，與中性粒細胞C5a受體結合，活化并促進中性粒細胞活性，加重炎癥反應［14］。LAMP-2A如何介導AAV的臨床損害，目前仍不清楚，本研究顯示，LAMP-A陽性患者C5a水平明顯高于陰性患者，且二者水平呈顯著正相關性，推測該抗體可能通過某種間接途徑，參與補體旁路途徑的激活，因為補體旁路途徑的激活，特異性抗體（除IgG4外）并非直接激活補體的主要途徑。

Kain et al［4］發現人LAMP-2蛋白與具有一型纖毛細胞的革蘭陰性菌的黏附素FimH有高度同源性，研究［4］表明69%LAMP-2A陽性FNGN患者患病之前12周內有FimH細菌感染史，從而認為感染菌的FimH與LAMP-2間的分子模擬是LAMP-2A產生的機制之一，但并非所有LAMP-2A陽性患者均感染FimH菌。本研究結果顯示，比較LAMP-2水平，MPO-AAV患者顯著高于健康對照者，LAMP-2A陽性患者LAMP-2、MPO水平明顯高于陰性患者，且LAMP-2A分別與LAMP-2及MPO呈顯著正相關性，據此推測，MPO-ANCA通過誘導中性粒細胞脫顆粒及炎癥破壞，可能增加血MPO及LAMP-2水平，其中，血循環中自身抗原LAMP-2的升高，一方面有利于其自身抗體LAMP-2A的形成，另一方面促進抗原抗體結合相關的免疫炎癥反應。

本研究顯示有48.44%的MPO-AAV患者中存在LAMP-2A，但兩種自身抗體MPO-ANCA與LAMP-2之間并無明顯的相關性，Kain et al［3］及Peschel et al［15］也發現，部分ANCA陰性的AAV患者體內存在LAMP-2A，顯示MPO-ANCA與LAMP-2A二種自身抗體間彼此的獨立性。本研究結果顯示LAMP-2A陽性與陰性患者間性別構成、病程并無差別，提示LAMP-2A的出現并非由于性別差異或慢性病程導致。LAMP-2A陽性與陰性患者間BVAS差異無統計學意義，且LAMP-2A水平與BVAS間也并無相關性，推測影響MPO-AAV患者病情活動性應該是多因素的，除LAMP-2A外，其他因素尚應包括MPO-ANCA、補體旁路途徑等。

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Investigation on the role of anti-lysosome-associated membrane protein-2 antibody in MPO-ANCA associated vasculitis

Gui Yadi，Shuai Zongwen，Hu Ziying，et al
（Dept of Rheumatology and Immunology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

Objective To preliminarily investigate the prevalence and role of anti-lysosome-associated membrane protein-2 antibody（LAMP-2A）in myeloperoxidase-antineutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis（MPOAAV）.Methods The peripheral blood from all patients was taken to detect LAMP-2A，myeloperoxidase-antineutrophil cytoplasmic antibody（MPO-ANCA），lysosome-associated membrane protein-2（LAMP-2），myeloperoxidase（MPO）and activated complement C5a by ELISA.These test results and some of other clinical indices were comparatively analyzed between LAMP-2A positive and negative group，and the relationships between LAMP-2A and either of these induces were also investigated.Results The positive rate of LAMP-2A was 48.44%in MPO-AAV patients.This positive rate showed no significant difference between patients with nephric/pulmonary damage and without nephric/pulmonary involvement.The LAMP-2 level in patient group was higher than that in control group（P＜0.001）.The levels of C5a，MPO and LAMP-2 in patients with positive LAMP-2A were significantly higher than that in patients without LAMP-2A（P＜0.01）.Moreover，LAMP-2A had markedly positive correlations with either of C5a，MPO and LAMP-2（rs=0.056，0.525，0.723；P＜0.001，respectively）while there was no obvious relationship between LAMP-2A and MPO-ANCA or BVAS.Conclusion LAMP-2A is a common autoantibody in MPOAAV and is independent from the other autoantibody MPO-ANCA.It might play an important role in the pathogenesis of clinical lesions in MPO-AAV by some way like promoting the activation of alternative complement pathway，combining with its elevated autoantigen LAMP-2 and so on.Further investigations on the exact roles of LAMP-2A in MPO-AAV are necessary.

antineutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis；myeloperoxidase；anti-lysosome-associated membrane protein-2 antibody；lysosome-associated membrane protein-2；complement activation；pathogenic mechanism

R 593.27

A

1000-1492（2016）08-1196-04

時間：2016-6-22 14：44：58

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160622.1444.056.html

2016-05-04 接收

中華醫學會臨床醫學科研專項資金項目（編號：08010290107）

安徽醫科大學第一附屬醫院風濕免疫科，合肥 230022作者簡介：桂雅迪，女，碩士研究生；

帥宗文，男，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：shuaizongwen@medmail.com.cn