深港兩地工程土壤真菌多樣性分析

龍 海， 章桂明， 汪 瑩， 程穎慧， 李芳榮， 王 穎， 高瑞芳， 李一農*

(1.深圳出入境檢驗檢疫局，廣東深圳 518001；2.深圳市檢驗檢疫科學研究院，深圳市外來有害生物檢測技術研發重點實驗室，廣東深圳 518045)

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深港兩地工程土壤真菌多樣性分析

龍 海1，2， 章桂明1， 汪 瑩1，2， 程穎慧1， 李芳榮1， 王 穎1， 高瑞芳1， 李一農1*

(1.深圳出入境檢驗檢疫局，廣東深圳 518001；2.深圳市檢驗檢疫科學研究院，深圳市外來有害生物檢測技術研發重點實驗室，廣東深圳 518045)

[目的]對深圳和香港工程土壤的真菌種類進行檢測。[方法]以深圳和香港兩地不同深度(0.5、10.0、20.0和30.0 m)的工程土壤為研究對象，結合形態學和ITS序列擴增并測序的方法，分析土壤真菌多樣性。[結果]共分離得到934個菌株，分別屬于79個屬132種。深圳土壤有14個屬19種；香港土壤有73個屬122種。66個屬113種只在香港有分布；7個屬10種只在深圳有分布。深港兩地均有分布的有7個屬9種。[結論]深港兩地工程土壤真菌種類有一定差異性；香港工程土壤真菌種類較多，其中還包括多種植物病原真菌，土壤入境前必須進行檢疫處理。

工程土壤；真菌多樣性；形態學；分子生物學

近年來，隨著我國“一帶一路”戰略的深入推進，與周邊國家或地區的跨境工程也正在籌劃或開工建設中，一部分工程土壤有可能會進入我國境內。這就會涉及到土壤檢疫問題，而我國目前缺乏相應的檢疫標準或方法。為了應對可能出現的問題，筆者以深港兩地不同深度的工程土壤為研究對象，結合形態學和分子生物學分析土壤真菌的多樣性，以期為后續風險分析和土壤檢疫處理提供科學依據。

1　材料與方法

1.1供試土樣在香港設3個取樣點，在深圳設2個取樣點，每個取樣點分別在0.5、10.0、20.0和30.0 m土層處各取1份樣品，每份樣品3～5 kg，裝入封口袋，置于土壤采集專用保藏箱(4 ℃)，并應盡可能在原有狀態下迅速送回實驗室，-20 ℃保存。采樣地點見表1。

1.2樣品制備將現場取回的20個原始樣品分別置于滅菌的搪瓷盤中混勻，制成平均樣品，棋盤式取5個平行樣，每個樣品100 g，研磨，用孔徑為2 mm的篩網過篩，去除雜質。共有100個試驗樣品。

1.3分離接種將試驗樣品每個稱取10 g加入盛有100 mL無菌水的500 mL三角瓶中，置于振蕩器上振蕩20 min，使土壤均勻分散在稀釋液中成為土壤懸液。土壤分散后，吸取5 mL土壤懸液到45 mL稀釋液中，依次按10倍法稀釋到10-3。 取1 mL 懸浮液均勻涂抹在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基平板上，于25 ℃ 培養。

表1　采樣地點及其地理坐標

1.4分離純化及菌株保存培養第2天開始觀察并記錄菌落數，對長出的菌絲及時純化到PDA培養基上，觀察記錄菌落的生長速度、顏色變化、孢子的形成情況等，并拍照和保存菌種。

1.5分子生物學檢測

1.5.1病菌的DNA提取。采用DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen)試劑盒提取真菌菌絲DNA。

1.5.2內轉錄間隔區(ITS)PCR擴增、測序和分析。應用引物ITS4(5′- TCCTCCGCTTATGATATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG - 3′)[1]對DNA 進行PCR 擴增。PCR 反應總體積為50.0 μL，反應體系：10×Buffer(含Mg2+)5 μL，2.5 μmol/L dNTP 5.0 μL，10 μmol/L ITS4/ITS5 各1.0 μL，5 U/μLTaqDNA聚合酶0.3 μL，模板DNA 1.5 μL，加ddH2O至50.0 μL。PCR 反應條件：95 ℃預變性3 min，經35個循環(92 ℃變性60 s，57 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s)，最后72 ℃延伸10 min[1]。取5.0 μL擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物用E.Z.N.A.TMCycle-Pure Kit純化回收試劑盒純化，方法按照說明書進行。純化后的PCR產物送至上?；瞪锛夹g有限公司進行測序分析。用BioEdit 7.0[2]對序列進行編輯，在GenBank 數據庫 (www.ncbi.nlm.nih.gov)中進行BLAST分析。

2　結果與分析

2.1分離純化對廣深港隧道工程5個取樣點共20份原始土壤樣品進行分離培養，共計934個菌株。各取樣點分離純化的菌株數和鑒定的種屬數見表2。由表2可知，取樣點A分離得到的菌株數最多，達373個，取樣點E分離得到的菌株數最少，僅118個；屬數以取樣點C最多，達37個，取樣點D最少，僅9個；種數以取樣點A最多，達55個，取樣點D最少，僅12個。對這些菌株全部進行了菌種保存和DNA提取。

表2各取樣點土壤中分離出的菌株數和鑒定的種屬數

Table 2The number of fungal strains isolated and species/genus identified in the soil of each sampling point

取樣點Samplingsites菌株數Thenumberofstrain屬數Thenumberofgenus種數ThenumberofspeciesA3733655B1623354C1303749D151912E1181015

2.2真菌多樣性由表3可知，深港兩地工程土壤中共鑒定出79個屬132個種真菌。香港土壤樣品中有真菌73個屬122種；深圳土壤樣品中有真菌14個屬19種。其中，66個屬113種真菌只存在于香港段土壤樣品中；7個屬10種真菌只存在于深圳段土壤樣品中。深港兩地工程土壤樣品中都存在的真菌為7個屬9種。

表3　深港兩地工程土壤中的真菌多樣性[3-4]

接下表

3　結論與討論

(1)該研究結果表明， 深港兩地工程土壤中的真菌種類有差異。從各取樣點的菌株和屬、種數量來看，香港米埔魚塘A點分離到的菌株數遠遠多于其他各取樣點分離到的菌株數，而其他4個取樣點分離到的菌株數量相差不多；對于屬和種的數量，香港取樣點的數量明顯多于深圳取樣點，原因有待進一步研究。深港兩地土壤樣品中的真菌優勢種群為青霉菌、鐮刀菌和曲霉菌，這些真菌種類繁多，分布廣泛，適應性強。香港土壤樣品中的特有種類大多是植物病原真菌，需要做進一步的風險分析和致病性研究。

(2) 用分離培養和形態學方法鑒定土壤中的真菌，缺點是周期較長，鑒定結果不準確，分離到的一些菌株鑒定不到種屬等。為了彌補形態學方法的不足，筆者利用分子生物學方法對形態學的鑒定結果進行驗證，盡量確保鑒定結果的準確性。對于土壤中不可培養的真菌，只能利用分子生物學方法進行檢測和鑒定。末端限制性片段長度多態性(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism, T-RFLP)技術和變性梯度凝膠電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE)指紋圖譜技術都可用于土壤真菌多樣性的分析[5-6]。這2種方法的優點是能夠較快和較全面地分析土壤中真菌群落的構成，缺點是難以得到菌株和進行后續研究。采用分離培養方法和分子生物學方法鑒定土壤真菌各有優缺點，可根據不同研究目的進行選擇，以期得到較為理想的結果。

[1] WHITE T, BRUN J, LEE S, et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetic[C]//INNIS M A, GLEFAND D H, SNINSKY J J, et al.PCR protocols: Acquire to methods and application.New York:Academia Press,1990:315-322.

[2] HALL T A. BioEdit: A user-friendly biological sequence alignmenteditor and analysis program for windows 95/98/NT[J].Nucleic acids symposium Series, 1999, 41:95-98.[3] 中華人民共和國WTO/TBT-SPS國家通報咨詢中心.中國國家有害生物檢疫信息平臺[DB/OL].www.pestchina.com.

[4] CABI.Crop protection compendium[M].Wallingford,UK:CAB International,2016.

[5] 尹承苗，王功帥，李園園，等.連作蘋果園土壤真菌的T-RFLP分析[J].生態學報，2014,34(4)：834-846.

[6] 夏圍圍，賈仲君.高通量測序和DGGE分析土壤微生物群落的技術評價[J].微生物學報，2014,54(12)：1489-1499.

Analysis of Fungal Diversity in Engineering Soils from Shenzhen and Hongkong

LONG Hai1,2,ZHANG Gui-ming1,WANG Ying1, 2,LI Yi-nong1*et al

(1. Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen, Guangdong 518001;2. Shenzhen Key Laboratory of Inspection Research & Development of Alien Pests,Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine, Shenzhen, Guangdong 518045)

[Objective] The aim was to detect the fungal diversity in engineering soils from Shenzhen and Hongkong. [Method]The engineering soils of different depths (0.5, 10.0, 20.0 and 30.0 ) in Hongkong and Shenzhen were studied.The fungal diversity in soil was analyzed by the methods of morphological and ITS region amplification and sequencing.[Result]A total of 934 strains were isolated, belonging to 79 genera and 132 species, respectively. There are 14 genera and 19 species in the soil sample of Shenzhen. There are 73 genera and 122 species in that of Hongkong. 66 genera, 113 species are distributed only in Hongkong; 7 genera, 10 species are distributed only in Shenzhen. 7 genera, 9 species are distributed in Shenzhen and Hongong.[Conclusion]The differences of fungal species in engineering soils between Shenzhen and Hongkong are significant.There are many kinds of fungi in the soil of Hongkong project, including many plant pathogenic fungi.Before entering, the soil must be treated with quarantine.

Engineering soils; Fungal diversity; Morphology; Molecular biology

國家質檢總局科技計劃項目(2015IK266)。

龍海(1979- )，男，安徽蒙城人，高級農藝師，博士，從事進出境植物檢疫工作。*通訊作者，研究員，從事植物病理學研究。

2016-07-20

S 154.3

A

0517-6611(2016)27-0097-03