葡萄汁有孢漢遜酵母和釀酒酵母的混合酒精發酵動力學

王星晨，胡 凱，陶永勝,2,*

（1.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西 楊凌 712100）

葡萄汁有孢漢遜酵母和釀酒酵母的混合酒精發酵動力學

王星晨1，胡 凱1，陶永勝1,2,*

（1.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西 楊凌 712100）

利用課題組前期優選的具有高β-葡萄糖苷酶活性的葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）研究其與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株混合發酵的動力學，為其葡萄酒增香釀造的應用提供理論和技術支持。實驗選用陜西楊凌的愛格麗葡萄為原料，設計優選菌株提前釀酒酵母48 h接種和同時接種兩個發酵處理，接種量1.0×106CFU/mL，同時用YPD液體培養基進行兩個處理的模擬發酵實驗，實驗以純釀酒酵母發酵為對照。發酵過程中監測不同酵母菌數量、酒精體積分數、還原糖等指標，建立動力學模型。結果表明，提前接種處理中優選菌株生存數量最多，生存時間最長，在其對數生長期酒精生成和還原糖消耗速率最慢，但整體酒精發酵正常，酒精生成量不受影響，說明發酵過程中不良副產物生成量有限。因此，優選菌株提前釀酒酵母接種的混合發酵具有葡萄酒增香釀造的應用可能。

有孢漢遜酵母；β-葡萄糖苷酶；釀酒酵母；混合酒精發酵；動力學

葡萄酒工業生產過程中應用純種釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的活性干粉啟動酒精發酵越來越普遍，單一菌種發酵在帶來發酵純正、酒精生成率高的同時，也引起葡萄酒風味特征同質化現象，因此混合菌種發酵逐漸受到釀酒師們的關注。事實上，葡萄自然酒精發酵過程是由非釀酒酵母（non-Saccharomyces）觸發的[1]，一些非釀酒酵母菌種的發酵會給葡萄酒質量帶來消極影響，比如醋酸、乙醛、甲硫醇含量的升高[2-3]。但進一步研究表明，某些非釀酒酵母可以增加葡萄酒感官質量特征的復雜性[4]，有效接種優選非釀酒酵母與釀酒酵母進行混合酒精發酵對提升葡萄酒感官質量有重要意義。有研究揭示了某些非釀酒酵母具有高活性的糖苷酶，能夠有效促進葡萄香氣前體物質的水解，生成游離的活性香氣成分，提升葡萄酒香氣質量[5]。不同非釀酒酵母菌株的活動對香氣物質生成的貢獻有差異，如美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）可促進中鏈脂肪酸、苯乙醇、乙酸異戊酯等的生成[6]，戴爾凱氏有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）可以產生更多的苯乙醇和多糖以及更低的揮發酸[7]，有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、季也蒙有孢漢遜酵母（Hanseniaspora guilliermondii）和嗜高壓有孢漢遜酵母（Hanseniaspora osmophila）等可發酵產生更高的乙酸酯類化合物，如乙酸苯乙酯和乙酸異戊酯[8-9]。盡管有研究將β-葡萄糖苷酶從非釀酒酵母中提取出來用于釀酒實驗并且取得了良好效果[10-12]，但是并不能完全體現相應菌株在釀酒實驗中的效果。因此，有研究篩選優良的非釀酒酵母菌種，與釀酒酵母混合酒精發酵，報道其提高葡萄酒風味成分和感官質量的數據[13-14]，但是有關非釀酒酵母與釀酒酵母混合發酵的動力學的研究較少，非釀酒酵母混合發酵過程中有效活動的數據缺乏。

本研究前期工作篩選獲得一株高產β-葡萄糖苷酶的葡萄汁有孢漢遜酵母，本實驗研究其與釀酒酵母混合酒精發酵的動力學，目的是從理論上揭示混合發酵過程中優選菌株生存數量、生存時間，糖消耗和酒精產率的規律，推斷其應用于葡萄酒增香釀造的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

愛格麗（Ecolly）葡萄，2014年8月采自陜西楊凌西北農林科技大學釀酒葡萄官村基地，含糖量185.6 g/L、含酸量6.7 g/L（以酒石酸計）。

1.2 菌種與培養基

葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum），其在WL固體培養基中的菌落形態光滑、綠色、扁平狀，并帶有透明環，基因庫登錄序列號：JQ678682.1，中國典型培養物保藏中心（保藏號CCTCC M 2013658）；釀酒酵母（F33型號釀酒酵母活性干粉） 法國Laffort公司。

YPD培養基（均為質量分數）：葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母浸粉1%，培養72 h，取其培養物上清液的β-葡萄糖苷酶，測得其酶活力為0.075 U/mL。

1.3 混合發酵接種方案

1.3.1 葡萄汁酒精發酵

愛格麗葡萄經除梗破碎后裝罐，同時加入50 mg/L的二氧化硫，在5 ℃條件下浸漬24 h后壓榨取汁，加入1.0 g/L膨潤土下膠澄清，澄清汁接種酵母菌。

提前接種：首先接種1.0×106CFU/mL優選菌株（H.uvarum），48 h后接種1.0×106CFU/mL釀酒酵母（酵母菌干粉經30 min活化，下同）；同時接種：1.0×106CFU/mL的H. uvarum和1.0×106CFU/mL的釀酒酵母同時接種；純釀酒酵母：只接種1.0×106CFU/mL釀酒酵母。其中H. uvarum采用YPD培養基濃縮菌懸液形式培養接種。

發酵溫度控制在18～20 ℃，待相對密度低于0.996，殘糖含量低于4 g/L時，終止發酵。

1.3.2 模擬酒精發酵

在250 mL的三角瓶中裝入等量的YPD液體培養基，在20 ℃條件下恒溫靜止進行模擬發酵。

模擬酒精發酵接種方案：提前接種、同時接種、純釀酒酵母，接種方案同1.3.1節。

1.4 指標檢測及處理方法

1.4.1 取樣方法

接種酵母菌后，每隔24 h于發酵液中取一定體積酒樣。其中葡萄汁發酵液中取上層液體，模擬發酵體系取樣前進行搖瓶，使沉淀的菌體均勻分布在發酵液中，然后取樣。

1.4.2 微生物計數方法

微生物菌落總數采用血球計數法，各菌種的數量采用WL固體培養基平板菌落計數法[15]。WL固體培養基配方參考文獻[16]方法。

1.4.3 酒精體積分數及還原糖含量測定

酒精體積分數采用密度瓶法測定；還原糖含量采用斐林試劑法測定[15]。

1.5 發酵模型建立方法[17-20]

菌體生長模型采用Monod模型，使用Logistic方程進行非線性擬合，Logistic方程：

式中：X為t時刻的菌體濃度/（107CFU/mL）；Xm為最大菌體濃度/（107CFU/mL）；B為常數；t為發酵時間/d；k為最大比生長速率/d－1。

酵母菌的厭氧發酵產物生成動力學模型使用Luedeking-Piret模型建立：

式中：C為發酵產物酒精的體積分數/%；α為與生長偶聯的產物形成系數；β為非生長偶聯的相關系數。

由于酒精是酵母菌生長的初級代謝產物，故其生長速率與菌體生長直接相關，所以酒精的生成屬于偶聯型，因此α≠0，β＝0。所以酒精生成方程可用Logistic方程直接進行擬合：

式中：C為酒精生成體積分數/%；Cm為酒精體積分數最大值/%；D為常數；μ為酒精生成最大比生成速率/d－1。1.6 數據統計

描述性統計量使用SPSS 18.0（SPSS Inc., Chicago IL, USA）進行計算，OriginPro 9.0進行非線性擬合。

2 結果與分析

2.1 發酵過程中不同酵母菌生長趨勢的變化

圖1 愛格麗葡萄汁酒精發酵中提前接種（A）、同時接種（B）和純釀酒酵母（C）體系的不同酵母菌生長趨勢變化Fig.1 Evolution of different yeasts during alcohol fermentation of grape juice in asynchronous (A), simultaneous inoculation (B), and pure S. cerevisiae (C) treatments

圖1 A提前接種處理中，在釀酒酵母接種前，H. uvarum生長繁殖迅速，在接種48 h時種群數量達到大約2.0×107CFU/mL，并在24 h后達到極大值約3.0×107CFU/mL，此后隨著釀酒酵母數量的增多，H. uvarum數量開始波動，并緩慢降低，但是直至發酵結束H. uvarum的數量仍維持在1.0×107CFU/mL左右。圖1B中，兩種酵母菌同時接種到葡萄汁中，H. uvarum只在接種后的24 h內迅速生長繁殖且速率明顯大于在提前接種處理中的速率，其最大濃度為2.0×107CFU/mL，但是此后H. uvarum菌體數量開始逐漸減少并在發酵第8天消失。

圖2 模擬體系酒精發酵中提前接種（A）、同時接種（B）、純釀酒酵母（C）體系的不同酵母菌生長趨勢變化Fig.2 Evolution of different yeasts during alcohol fermentation of YPD medium in asynchronous (A), simultaneous inoculation (B), and pure S. cerevisiae (C) treatments

YPD培養基模擬酒精發酵過程中的各個接種處理不同酵母菌的數量變化過程見圖2。在模擬發酵體系中，H. uvarum表現了與在葡萄汁中相似的對比結果，H. uvarum的數量在提前接種處理中總體呈現增長的趨勢，且最大值達到了3.5×107CFU/mL（圖2A），而在同時接種處理中，H. uvarum的數量在開始時最大，為2.0×107CFU/mL，此后便一直呈現下降趨勢，并在發酵第8天消失（圖2B）。模擬發酵與葡萄汁發酵所得的相似的結果證明H. uvarum在提前接種混合發酵體系中比在同時接種混合發酵體系中存在的時間更長，數量更多，表明提前接種處理的發酵液更有潛力獲得更多的β-葡萄糖苷酶，進而更有可能水解更多的香氣糖苷，因此具有葡萄酒增香釀造的應用可能。

2.2 酵母菌生長動力學

圖3A是葡萄汁酒精發酵過程中3 種接種方式的酵母菌生長動力學曲線，模型使用發酵前5 d的數據進行擬合，后6 d未進行擬合。圖3B是模擬體系3 種接種方式的酵母菌生長動力學曲線。葡萄汁發酵和模擬體系發酵各個處理的酵母菌生長動力學擬合的相關參數見表1。

圖3 葡萄汁酒精發酵（A）和模擬體系酒精發酵（B）微生物生長動力學擬合Fig.3 Yeast growth kinetics for alcohol fermentation of grape juice (A) and YPD medium (B)

由圖3A可知，與其他兩種接種方式相比，提前接種處理差異明顯，具體表現為細胞數量在接種初期增加緩慢，從第2天進入對數期，且對數期細胞繁殖速率明顯高于另外兩個體系，第4天時進入平衡期，在平衡期細胞最大濃度為12.6×107CFU/mL。在細胞數衰減階段，提前接種處理的衰減速率最慢，且在發酵結束后的菌體濃度大約是4.0×107CFU/mL。同時接種和純釀酒酵母發酵體系中酵母菌生長模型在發酵前3 d類似，即接種后的第2天進入對數期，第4天進入平衡期，差別在于平衡期兩個發酵體系的細胞最大濃度分別為12.0×107CFU/mL和10.0×107CFU/mL，平衡期后細胞基本同步衰減直至發酵結束，發酵結束時的細胞濃度大約是1.0×107CFU/mL，明顯低于提前接種處理。結合圖1，在平衡期時提前接種處理的總酵母菌數量最多，且H. uvarum占總酵母菌數的比例大于同時接種處理的，因此提前接種處理中，H. uvarum對葡萄酒質量的影響更大。

表1 葡萄汁與模擬體系酒精發酵酵母菌生長動力學參數Table1 Kinetic parameters of yeast growth during alcohol fermentation of grape juice and YPD medium

2.3 產物生成動力學和底物消耗動力學

圖4 葡萄汁酒精發酵產物生成動力學（A）和底物消耗動力學（B）擬合圖Fig.4 Kinetics of ethanol production (A) and substrate consumption (B) during alcohol fermentation of grape juice

由圖4A可知，各處理酒精生成的最終結果相近，但累積過程差異明顯。提前接種處理的酒精累積速率最慢，在發酵開始的48 h內，H. uvarum數量小，因而酒精的累積速率非常低，而隨著釀酒酵母的接種以及體系中總酵母菌數量的增加，酒精累積速率迅速升高并在發酵結束時達到最大值。由圖4B可知，還原糖消耗動力學中同樣是提前接種處理最慢，在發酵開始的48 h內，還原糖以微弱的速率被消耗，而隨后的2 d內還原糖含量快速降低，此后以較為平緩的速率被消耗直到發酵結束。結合圖3中微生物群體演變規律，可以發現酵母菌數量的變化過程正是酒精體積分數累積速率和還原糖消耗速率變化的直接原因。

表2是酒精生成動力學參數擬合結果，3 個發酵體系最終擬合的最大酒精體積分數均大約為11.5%，表明H. uvarum的接種生長并沒有顯著地影響到底物糖的代謝和產物酒精的生成，產生不良風味副產物的可能性很小。

表2 酒精生成動力學擬合參數Table2 Kinetic parameters for alcohol production

3 討 論

在葡萄酒酒精發酵過程中，采用干質量法測定的酵母菌生長趨勢變化規律遵循典型的“S”形曲線[21]，但是自發酵平衡期末，酵母菌總數量包括活菌體和死亡菌體，死亡菌體對于酒精發酵速率沒有直接貢獻。因此，本實驗中愛格麗葡萄汁酒精發酵過程中酵母菌的數量變化采用WL固體培養基計數，顯示了活酵母菌在酒精發酵中的數量演變過程，有助于揭示不同接種發酵處理的發酵過程中酵母菌變化的差異，從而以此判斷優選酵母菌株對葡萄酒質量可能的影響。

在單一酵母菌的酒精發酵實驗中，酵母菌總數一般在第3天便達到最大值[21-22]，本實驗結果亦顯示酵母菌數量在第3天達到最大值。有研究發現，在釀酒酵母與季也蒙有孢漢遜酵母（H. guilliermondii）和異常畢赤酵母（P. anomala）的混合酒精發酵處理中，釀酒酵母在發酵第5天便占據主導地位，且兩種非釀酒酵母完全消失[22]。而本實驗的接種處理中，葡萄汁有孢漢遜酵母（H. uvarum）在同時接種處理中第8天消失，但是在提前接種處理的發酵過程中一直存活，表明H. uvarum在釀酒酵母前48 h接種有助于其自身的生長繁殖和生存。

Comitini等[6]研究發現非釀酒酵母對于發酵液中酵母菌生長動力學的影響可能與它的細胞濃度和存活的時間有關系，當非釀酒酵母與釀酒酵母的接種體積比是1∶1時，釀酒酵母的生長不受影響，而當比例提高時（100∶1或者10 000∶1），非釀酒酵母就會對釀酒酵母的生長產生顯著的影響。本實驗中，同時接種處理和純釀酒酵母發酵體系中酵母菌生長曲線相似，同樣說明當非釀酒酵母與釀酒酵母接種數量接近時，釀酒酵母的生長不受非釀酒酵母的影響。Yamaoka等[23]在釀酒酵母與乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）的混合發酵過程中，發現后者代謝產生的甘油、丙氨酸等物質可以改變釀酒酵母細胞內氨基酸水平，延長其細胞生命周期。由此推斷，本實驗提前接種處理表現出最高的細胞濃度以及后期較低的衰減速率和較少的衰減數量，極有可能是由于H. uvarum在發酵前期產生并積累了的一些物質，使得酵母菌生長周期延長。發酵后期較高的菌群密度可以有效避免葡萄酒酒精發酵的意外終止，同時酵母菌總體中H. uvarum的高比例和更長的存活時間會提高發酵液中β-葡萄糖苷酶的含量，從而有利于香氣前體物質的水解釋放。

此前有研究得出，非釀酒酵母和釀酒酵母混合酒精發酵在平衡期的酵母菌總數多于純釀酒酵母發酵的處理，但是前者的發酵速率和產酒精率低于后者[24-25]。研究[26]發現，將釀酒酵母接種到非釀酒酵母發酵一段時間的葡萄汁中，所釀葡萄酒與同時接種的混合發酵所釀葡萄酒在最終風味產物上大不一樣，前者香氣更為復雜。本實驗中不同酵母菌的接種處理并不影響酒精發酵的正常進行，雖然H. uvarum提前接種處理開始的糖消耗和酒精生成率較低，但隨著酵母菌數量的增加，底物消耗和產物生產的速率與對照開始接近，最終不同接種處理的發酵過程在底物消耗量和產物生成量上沒有顯著差別。

以上優選葡萄汁有孢漢遜酵母和釀酒酵母混合酒精發酵的動力學分析顯示，在酒精發酵全過程中，提前接種處理的優選菌株生存數量最多，生存時間最長，雖然在其對數生長期酒精生成和還原糖消耗速率最慢，但整體酒精發酵正常，酒精生成量不受影響，說明優選菌株發酵過程中產生不良氣味副產物的可能性較小，優選菌株提前釀酒酵母48 h接種進行混合酒精發酵具有葡萄酒增香釀造的應用潛力。

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Kinetics of Alcohol Fermentation by Mixed Cultures of Hanseniaspora uvarum and Saccharomyces cerevisiae

WANG Xingchen1, HU Kai1, TAO Yongsheng1,2,*
(1. College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2. Shaanxi Engineering Research Center for Viti-Viniculture, Yangling 712100, China)

A strain of Hanseniaspora uvarum with high activity β-glucosidase has been isolated in our previous study. In this work we conducted a ki netic study on alcohol fermentation by mixed cultures of the isolate and Saccharomyces cerevisiae with the aim to find out the theoretical basis and technical support for the application of the strain of Hanseniaspora uvarum in winemaking for aroma enhancement. Ecolly grapes in Yangling, Shaanxi were used as raw materials for winemaking. Two treatments, inoculation of the isolate 48 h earlier than S. cerevisiae and simultaneous inoculation, were designed. The inoculation amount of the isolate was 1.0 × 106CFU/mL. The fermentation of these two treatments with YPD liquid medium as grape juice model system was also performed. The fermentation with S. cerevisiae alone was set as the control. During fermentation, the amount of different yeast strains, alcohol production and residual sugar were recorded. Then the kinetic equations were built. Results showed that, in the asynchronous inoculation treatment, the live isolate subsisted for a longer time and its amount was higher than that in the other treatment and the control. In the logarithmic period of the isolate, alcohol production and sugar consumption were both lower than those in the other treatment and the control. In addition, its alcohol fermentation was normal and the final alcohol production was the same as that in two other treatments. It could be concluded that inoculation of the isolate 48 h earlier than S. cerevisiae could show better hydrolysis of aroma precursors by β-glucosidase during winemaking, and it will have promising applications in winemaking for aroma enhancement.

Hanseniaspora uvarum; β-glucosidase; Saccharomyces cerevisiae; mixed culture fermentation; kinetics

10.7506/spkx1002-6630-201603020

TS261.4

A

1002-6630（2016）03-0103-06

王星晨, 胡凱, 陶永勝. 葡萄汁有孢漢遜酵母和釀酒酵母的混合酒精發酵動力學[J]. 食品科學, 2016, 37(3): 103-108. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603020. http://www.spkx.net.cn

WANG Xingchen, HU Kai, TAO Yongsheng. Kinetics of alcohol fermentation by mixed cultures of Hanseniaspora uvarum and Saccharomyces cerevisiae[J]. Food Science, 2016, 37(3): 103-108. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201603020. http://www.spkx.net.cn

2015-09-29

國家自然科學基金面上項目（31371724）

王星晨（1990—），男，碩士研究生，主要從事葡萄酒釀造技術研究。E-mail：xing-chenwang@qq.com

*通信作者：陶永勝（1977—），男，副教授，博士，主要從事葡萄酒釀造與風味化學研究。E-mail：taoyongsheng@nwsuaf.com.cn