以殼聚糖納米微球為載體的Crisp1-DNA避孕疫苗的制備及體外表達

羅金，楊菁，程琰，張怡，徐望明

(武漢大學人民醫院生殖醫學中心，武漢　430060)

?

·實驗研究·

以殼聚糖納米微球為載體的Crisp1-DNA避孕疫苗的制備及體外表達

羅金，楊菁*，程琰，張怡，徐望明

(武漢大學人民醫院生殖醫學中心，武漢430060)

目的構建以殼聚糖納米微球為載體的Crisp1 DNA疫苗，對其物理學、生物學活性進行測定，并評估其在COS-7細胞中的表達情況及細胞毒性。方法采用本實驗室前期構建的真核表達質粒pcDNA3.1-Crisp1，以復凝法制備載Crisp1 DNA疫苗的殼聚糖納米粒(CS/DNA NPs)，用透射電鏡以及凝膠阻滯分析對其相關物理學、生物學活性進行測定，然后將載Crisp1 DNA疫苗的殼聚糖納米粒轉染至COS-7細胞，檢測其細胞毒性，并用間接免疫熒光法鑒定其在細胞內的表達情況。結果透射電鏡結果顯示納米粒形態較均一，平均粒徑為189.3 nm，Zeta電位約為+0.2 mV。凝膠阻滯分析顯示殼聚糖微粒可將DNA疫苗完全阻滯于加樣孔中并保護DNA質粒不降解。MTT試驗顯示殼聚糖組細胞存活率顯著高于脂質體組(P<0.01)。間接免疫熒光實驗結果顯示CS/DNA NPs能在COS-7細胞中有效表達Crisp 1抗原蛋白。結論由殼聚糖納米微球介導的Crisp1 DNA疫苗，可在真核細胞中有效地表達，且具有較小的細胞毒性，為進一步發展安全有效的DNA避孕疫苗打下了基礎。

Crisp-1；避孕；DNA疫苗；殼聚糖；納米微球

Methods：The eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1-Crisp1 was constructed previously and encapsulated in nanoparticles with chitosan by complex coacervation process. Transmission electron microscope (TEM) and Gel retardation assay were used to observe the physical and biological characteristics of the chitosan/pcDNA3.1-Crisp1 nanoparticles. Then，the chitosan/pcDNA3.1-Crisp1 nanoparticles (CS/DNA NPs) were transfected to COS-7 cells，detecting its cytotoxicity and evaluating its expression by indirect immunoflurescence.

Results：TEM showed that chitosan/pcDNA3.1-Crisp1 nanoparticleshad symmetrical shape，with a diameter about 189.3 nm，and zeta potential was+0.2 mV. Gel retardation assay showed that pcDNA3.1-Crisp1 contained in chitosan nanoparticles could be completely retarded and remained intact after DNase I treatment. MTT assay showed that the viability of cells incubated with chitosan-DNA was significantly higher than that of the control Lipofect 2 000 group (P<0.01). Indirect immunouorescence showed that pcDNA3.1-Crisp1 could expressed effectively in COS-7 cells.

Conclusions：Chitosan nanoparticles containing Crisp1-DNA contraceptive vaccine can express effectively in eukaryotic cells and have less cytotoxicity. Chitosan can be used as an effective non-virus DAN vaccine carrier.

(JReprodMed2016，25(10)：947-952)

富含半胱氨酸分泌蛋白-1(cysteine-rich secretory protein-1，Crisp1)是由附睪頭部的上皮細胞合成分泌的一種雄激素依賴型糖蛋白。由于在生殖過程中的多個環節起著重要作用，如調控精子的獲能、參與精卵融合等，Crisp1被認為是一種極具前景的候選避孕疫苗[1-3]。在前期的研究中，本實驗室成功的構建了真核表達載體pcDNA3.1-Crisp1[4]，并證實該疫苗可在小鼠體內誘導特異性免疫反應，但避孕效果不盡理想[5-6]。其原因可能是：(1)由于裸DNA帶負電荷，難以通過脂質的細胞膜；(2)在體內易被核酸酶降解而迅速清除[7]；(3)質粒DNA轉運到組織細胞尤其是抗原遞呈細胞(APc)的效率較低，從而導致抗原表達水平低下[8]。因此，要成功將基因免疫用于開發避孕疫苗，還需要選擇一個合適的基因給藥載體，以提高 DNA疫苗在體內主動免疫效果。目前，非病毒載體由于具有較好的生物安全性已越來越多地運用于基因治療研究中。殼聚糖是一種帶正電荷的天然聚合物，無細胞毒性，且具有很好的生物相容性和生物降解性[9]，近年來作為一種新開發的載體系統得到了廣泛而深入的研究。本研究采用復凝法構建了載Crisp1 DNA疫苗的殼聚糖納米粒，并對其相關物理學、生物學活性進行測定，最后通過與脂質體進行比較評估其在COS-7細胞中的表達情況，望能為后續研究其生物學活性及免疫避孕效應提供基礎依據。

材料和方法

一、材料

1. 主要試劑：殼聚糖購自sigma公司；Lipofectamne 2000TM試劑盒和Opti-MEM培養基為Invitrogen公司產品；其余試劑均為國產或進口分析純。

2. 細菌、細胞和質粒：pcDNA3.1-Crisp1真核表達質粒由本實驗室前期構建[4]；載體pcDNA3.1 為Novagen 公司產品；COS-7 細胞購自中國科學院上海細胞生物與生物化學所。

二、研究方法

1. 載Crisp-1DNA疫苗殼聚糖納米粒的制備(復凝法)：根據前期文獻報道，采用復凝法制備殼聚糖納米粒[10]。稱取純化的殼聚糖10.0 mg，溶解于l%冰乙酸溶液中，用NaOH調節pH至5.5，稀釋溶液使殼聚耱濃度為0.02%(W/V)，0.22 μm針式濾器過濾除菌。取適量pcDNA3.1-Crisp1加入25 mmol/L Na2S04溶液中，調節其濃度分別為50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml，分別記為CS/DNA 50、CS/DNA 100、CS/DNA 200。將0.02%殼聚糖溶液和3種不同濃度的pcDNA3.1-Crisp1/Na2S04(25 mmol/L)溶液均預熱至55℃，分別取等體積的殼聚糖溶液與pcDNA3.1-Crisp1溶液迅速混勻，渦旋30 s，室溫靜置30 min，所得pcDNA3.1-Crisp1-殼聚糖納米粒懸液即可用于生物學鑒定和細胞轉染。取不同質粒濃度的納米粒懸液200 μl，高速離心機離心(14 000g×30 min)，收集上清液，紫外分光光度法(OD260)檢測上清液中質粒DNA的含量，并計算不同質粒濃度下的包埋率。

基因含量(包埋量，μg)=OD260×稀釋倍數×體積×50/1 000；

包埋率G(%)=[(Wo-wo)/Wo]×100%(Wo為加入的DNA的總量；wo為上清液中剩余的DNA的量)。

2. 納米粒形態、粒徑分布及zeta電位的測定：取少量納米粒混懸液滴至鋪有碳膜的銅網上，靜置2 min，用濾紙吸干混懸液，再滴加2%磷鎢酸負染2 min，于透射電子顯微鏡(TEM)下觀察納米粒形態，并選取有代表性的視野拍照，進行形態測定。另取納米粒混懸液適量，加雙蒸水稀釋后用納米粒度分析儀測定平均粒徑、多分散度和zeta電位。

3. 凝膠阻滯分析和DNase I保護試驗：分別取裸質粒和殼聚糖納米質粒復合物，行含0.5 μg/ml溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠電泳(100 V，30 min)，紫外凝膠成像儀觀察并照相，分析殼聚糖納米粒與質粒的結合力。由于裸質粒DNA在體內易被降解，為驗證納米粒對質粒DAN的保護作用，選用核酸酶(DNase I)作為酶原進行抗核酸試驗。取樣本和裸質粒DNA 溶液各20 μl (含質粒DNA 1 μg)，分別加入0.2 μl DNaseI，37℃反應30 min，0℃冰浴15 mim終止反應，以含0.5 μg/ml溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠進行電泳分析(100 V，30 min)，同時與未加酶的殼聚糖納米質粒復合物樣品和裸質粒溶液對照。

4. 細胞毒性檢測(MTT)：COS-7 細胞用含有10%胎牛血清的杜爾伯科極限必需培養基(DMEM)，37℃、5% CO2恒溫培養。用0.25%胰酶消化單層培養的COS-7細胞，以每孔內1×104個細胞接種于96孔板，培養至細胞貼壁后，將裸DNA、脂質體-質粒DNA、及殼聚糖-質粒DNA分別加入細胞孔中，只加培養液的空白孔調零，非處理細胞為對照。溫箱中培養48 h后取出96孔板，加入MTT 20 μl，繼續培養4 h。吸棄全部上清液，每孔加入150 μl 二甲基亞砜(DMSO)，震蕩10 min，選擇570 nm波長，以空白孔調零，酶標儀測其吸光度值并計算各組細胞存活率。細胞存活率=[OD570(實驗組)/OD570(對照組)] × 100%。

5. 間接免疫熒光細胞化學檢測Crisp1蛋白在真核細胞中的表達與定位：轉染48 h后，吸棄培養基，PBS洗3次，用4%多聚甲醛-PBS固定液室溫固定15 min，吸出固定液，PBS洗3次，0.5 ml 0.2%的Triton-X 100溶液破膜8 min，PBS洗3次，正常山羊血清室溫(37℃)下封閉20 min，PBS洗3次，滴加一抗(山羊抗鼠CRISP-1單抗，1∶100稀釋) 4℃過夜，PBS洗3次，滴加二抗(FITC標記的兔抗山羊IgG，1∶100稀釋)，37℃避光孵育90 min，PBS洗3次，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

三、統計學分析

結　　果

一、不同質粒濃度下殼聚糖對pcDNA3.1-Crisp1的包埋率

采用紫外分光光度儀檢測殼聚糖對不同濃度的質粒DNA的包埋率，結果顯示，質粒濃度為100 μg/ml時，殼聚糖對質粒DNA的包埋率最高(表1)。

表1　不同質粒濃度下殼聚糖對pcDNA3.1-Crisp1的包埋率

注：分別與低、高濃度組相比，*P<0.05

二、殼聚糖/pcDNA3.1-Crisp1納米粒的物理學特征

透射電子顯微鏡觀察結果顯示，載基因殼聚糖納米粒形態較為規則，近球形，大小較均一，散在分布，分散性好(圖1)。激光粒度分析儀測定結果表明，納米粒直徑約189.3 nm，多分散指數為0.459，粒徑分布范圍較窄。Zeta電位約為+0.2 mV。

圖1　殼聚糖/pcDNA3.1-Crisp-1納米粒透射電鏡成像

三、凝膠阻滯分析和DNase I保護試驗

1%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，殼聚糖與DNA疫苗后結合使質粒DNA阻滯于加樣孔中，未觀察到質粒跑出，說明殼聚糖能有效地包裹質粒DNA(圖2A)。但是，向各組樣品加入DNase I后，電泳結果顯示裸質粒DNA被DNase I消化；而殼聚糖納米微粒中的質粒DNA并未受影響，說明殼聚糖能保護質粒DNA不受核酸酶降解(圖2B)。

A：殼聚糖納米粒與質粒DNA結合試驗電泳圖，1：Marker；2：質粒DNA組；3-5：pcDNA3.1-Crisp-1殼聚糖微粒組。B：殼聚糖納米粒對質粒DNA保護試驗電泳圖，1：Marker；2：質粒DNA組；3-5：pcDNA3.1-Crisp-1殼聚糖微粒組圖2　殼聚糖納米粒與質粒DNA凝膠電泳圖譜

四、細胞毒性檢測(MTT)

MTT試驗結果顯示裸 DNA、脂質體-質粒DNA、CS/DNA NPs三組的細胞存活率分別為(86.74±3.26)%、(29.13±4.02)%、(80.32±6.23)%。殼聚糖組與裸質粒組細胞存活率差異無統計學意義(P>0.05)，但顯著高于脂質體-DNA組，差異有統計學意義(P<0.01) (圖3)。

五、間接免疫熒光細胞化學檢測Crisp-1在真核細胞中的表達

將正常COS-7細胞和經不同方式轉染pcDNA3.1-Crisp1的COS-7細胞用4%多聚甲醛-PBS固定液固定后，分別做間接免疫熒光(IIF)檢測。如圖4所示，經過相同處理后，無論是用脂質體介導轉染的COS-7細胞中還是載DNA殼聚糖納米微球直接轉染的COS-7細胞中均可看到明亮的綠色熒光，表明殼聚糖可有效的介導Crisp1 DNA疫苗在真核細胞中表達。

組間兩兩分別比較，*P<0.01圖3　各組細胞毒性檢測后細胞存活率

A：以殼聚糖納米粒介導的pcDNA3.1-Crisp1質粒轉染的COS-7細胞；B：經脂質體介導的pcDNA3.1-Crisp1質粒轉染的COS-7細胞；C：未經質粒轉染的正常COS-7細胞圖4　pcDNA3.1-Crisp1質粒經不同方法轉染COS-7細胞后Crisp1的熒光表達

討　　論

近年來，隨著基因組學和蛋白質組學技術的應用和發展，采用重組DNA技術，以精子相關蛋白為基礎研究，在多個動物模型上已證實可產生抗體反應并顯示出一定的抗生育效果。Crisp1是一種雄激素依賴性的分泌性糖蛋白，由附睪頭部的上皮細胞合成并分泌。有研究表明Crisp1不僅參與了精卵融合[1-2]，還參與了精子與透明帶的相互作用階段[8]，并可調節精子在附睪中獲能[3]。最近，Maldera等[11]研究進一步發現，人類附睪Crisp1主要是通過與透明帶3(ZP3)的相互作用介導精子-透明帶結合，參與受精過程。在前期的研究中，本課題組成功的構建了以Crisp1為基礎的DNA避孕疫苗[4]，并對雌雄性小鼠進行主動免疫，結果顯示免疫后雌雄性小鼠血清內均可檢測到特異性抗Crisp1的IgG抗體，且抗體滴度隨著免疫時間延長而逐漸升高，停止免疫后4周抗體滴度開始緩慢下降[5-6]，并進一步證實了mCrisp1抗體特異性作用于精卵融合階段，而對正常小鼠附睪精子的活動率、存活率、自發或誘發頂體反應率及精子粘附卵的能力均無影響[12]，但是該疫苗對小鼠的抗生育作用并不十分理想，免疫后僅能使小鼠的生育力降低30%左右，且與重組Crisp1蛋白相比，其免疫原性較低[5-6]，因此要提高DNA疫苗的免疫原性，選擇一種合適的載體非常重要。

殼聚糖是一種天然的陽離子聚合物，來源廣泛，價格低廉，具有較高的生物相容性和生物降解性，并且易與DNA結合形成納米微粒[13]。有文獻報導殼聚糖還具有免疫佐劑的功能，能優化DNA疫苗接種的效果[14-15]。本實驗采用經典的復凝法制備殼聚糖/pcDNA3.1-Crisp1納米微粒，主要是利用殼聚糖與DNA疫苗之間的靜電作用和硫酸鈉對殼聚糖的鹽析作用，使殼聚糖分子和質粒DNA分子復合壓縮并包裹纏繞，形成納米顆粒，然后從體系中析出形成殼聚糖-DNA疫苗納米粒膠體混懸液。采用這種方法制備的殼聚糖納米粒，在制備過程中未加入任何有機溶劑，制備條件溫和，從而保護了質粒基因的結構和功能。用紫外分光光度法檢測殼聚糖-DNA疫苗納米粒對質粒DNA的包埋率，結果顯示在質粒DNA濃度為100 μg/ml時，殼聚糖對質粒DNA的包埋率高達94%，而凝膠阻滯分析實驗中，殼聚糖-DNA疫苗納米粒組質粒DNA全部被阻滯在加樣孔中，證明質粒DNA幾乎全部被殼聚糖包裹，與包埋率檢測結果一致。說明采用該方法制備 CS/DNA納米粒切實可行。導致裸質粒DNA免疫效應低下的原因之一是其在體內易被核酸酶降解，本實驗中，采用DNase I消化實驗檢測CS-pcDNA3.1-Crisp1納米復合物的抗核酸酶能力，結果發現當DNase I濃度為25 U/ml，遠超過生理劑量時，CS-pcDNA3.1-Crisp1納米復合物能有效保護DNA不被降解。

納米粒能否被細胞有效吸收的兩個重要影響因素為納米粒的表面電荷和粒徑大小，帶正電的納米粒可以與帶負電的細胞膜進行靜電作用，而殼聚糖-DNA基因傳遞系統主要通過內吞或胞飲進入細胞，因此納米粒徑的大小直接影響細胞對納米粒的吸收[16]。本實驗所獲得的納米粒形態規則，大小均一，分散性好，且經納米粒度分析儀檢測顯示納米粒Zeta電位為+0.2 mV，改變了DNA疫苗本身帶負電荷的性質，使其更容易通過細胞膜被機體吸收。

殼聚糖能否介導質粒成功轉染至真核細胞中并獲得表達是實驗關鍵點所在。本實驗采用兩種不同的方法轉染COS-7細胞，結果顯示以殼聚糖納米粒為載體的pcDNA3.1-Crisp-1可在COS-7細胞中有效表達，且與脂質體轉染后表達部位一致。由于脂質體可以改變所包裹藥物在體內的分布，特異性地靶向腫瘤組織，提高藥物療效，降低藥物毒性，因此，近年來，脂質體作為藥物傳輸系統在抗癌藥物的制備中應用廣泛[17]，但其潛在的細胞毒性給脂質體的應用帶來了局限性。雖然有報道稱陽離子脂質體在細胞內釋放核酸后會自我降解，但如果細胞攝入大量的陽離子脂質體，將對細胞產生較大的毒性作用，引起細胞凋亡或壞死[18]。在本實驗中，采用MTT試驗對兩種方法轉染后COS-7細胞的存活率進行檢測，結果顯示：與脂質體Lipofectamine 2000TM轉染方法相比，殼聚糖組細胞存活率顯著高于脂質體組(P<0.01)，說明殼聚糖微粒具有較小的細胞毒性和較高的安全性。

綜上所述，本實驗成功地構建了以殼聚糖納米微粒為載體的CRISP1-DNA避孕疫苗，并證實殼聚糖可作為有效地DNA避孕疫苗給藥載體，且安全無毒性。

致謝

感謝武漢大學物理學院納米中心周張凱博士和中國科學院水生所電鏡中心袁秀云老師在實驗過程中給予的幫助與指導。

[1]Cohen DJ，Ellerman DA，Cuasnicú PS. Mammalian sperm-egg fusion：evidence that epididymal protein DE plays a role in mouse gamete fusion[J]. Biol Reprod，2000，63：462-468.

[2]Roberts KP，Wamstad JA，Ensrud KM，et al. Inhibition of capacitation-associated tyrosine phosphorylation signaling in rat sperm by epididymal protein Crisp-1[J]. Biol Reprod，2003，69：572-581.

[3]Visconti PE，Westbrook VA，Chertihin O，et al. Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity[J]. J Reprod Immunol，2002，53：133-150.

[4]羅金，楊菁，徐望明，等. 小鼠富含半胱氨酸分泌蛋白-1真核表達載體的構建及其在COS-7細胞中的表達[J]. 生殖與避孕，2010，30：509-513.

[5]羅金，楊菁，程琰，等. 小鼠富含半胱氨酸分泌蛋白-1DNA疫苗免疫避孕效果的評價[J]. 生殖與避孕，2013，33：145-148.

[6]Luo J，Yang J，Cheng Y，et al. Immunogenicity study of plasmid DNA encoding mouse cysteine-rich secretory protein-1 (mCRISP1) as a contraceptive vaccine[J]. Am J Reprod Immunol，2012，68：47-55.

[7]Wolff JA，Malone RW，Williams P，et a1. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo[J]. Scienc，1990，247：1465-1468.

[8]Mansouri S，Cuie Y，Winnik F，et al. Characterization of folate-chitosan-DNA nanoparticles for gene therapy[J]. Biomaterials，2006，27：2060-2065.

[9]Guliyeva U，Oner F，Ozsoy S，et al. Chitosan microparticles containing plasmid DNA as potential oral gene delivery system[J]. Eur J Pharm Biopharm，2006，62：17-25.

[10]Busso D，Cohen DJ，Maldera JA，et al. A novel function for CRISP1 in rodent fertilization：involvement in sperm-zona pellucida interaction[J]. Biol Reprod，2007，77：848-854.

[11]Maldera JA，Weigel Muoz M，Chirinos M，et al. Human fertilization：epididymal hCRISP1 mediates sperm-zona pellucida binding through its interaction with ZP3[J]. Mol Hum Reprod，2014，20：341-349.

[12]羅金，劉雪麗，楊菁，等. 小鼠富含半胱氨酸分泌蛋白-1特異性抗體的抗生育作用機制[J]. 武漢大學學報(醫學版)，2016，37：249-253.

[13]Aiba S. Solution stability and reactivity of partially N-acetylated chitosan derivatives in aqueous media[J]. Int J Biol Macromol，1989，11：249-252.

[14]Xu J，Dai W，Wang Z，et al. Intranasal vaccination with chitosan-DNA nanoparticles expressing pneumococcal surface antigen a protects mice against nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae[J]. Clin Vaccine Immunol，2011，18：75-81.

[15]Sui Z，Chen Q，Fang F，et al. Cross-protection against influenza virus infection by intranasal administration of M1-based vaccine with chitosan as an adjuvant[J]. Vaccine，2010，28：7690-7698.

[16]Erbacher P，Zou S，Bettinger T，et al. Chitosan-based vector/DNA complexes for gene delivery：biophysical characteristics and transfection ability[J]. Pharm Res，1998，15：1332-1339.

[17]盛竹君，徐維平，徐婷娟，等. 脂質體藥物傳輸系統的研究新進展[J]. 中國藥業，2015，24：6-8.

[18]林梟，崔韶暉，趙軼男，等. 陽離子脂質體的細胞毒性[J]. 生命的化學，2016，36：50-56.

[編輯：侯麗]

Preparation of chitosan nanoparticles containing Crisp1-DNA contraceptive vaccine and its expression in vitro

LUO Jin，YANG Jing*，CHEN Yan，ZHANG Yi，XU Wang-ming

ReproductiveMedicalCenter，RenminHospitalofWuhanUniversity，Wuhan430060

Objective：To construct chitosan nanoparticles containing Crisp1 DNA contraceptive vaccine，determine its physical and biological characteristics，and evaluate its expression in COS-7 cells.

Cysteine-rich secretory protein-1(Crisp1)；Chitosan；DNA vaccine；Immunocontraception；Nanoparticles

10.3969/j.issn.1004-3845.2016.10.018

2016-04-04；

2016-04-23

國家自然科學基金資助項目(81501306)

羅金，女，湖北天門人，博士，生殖醫學專業.(*