益氣活血復方對動脈粥樣硬化家兔NF-κB基因表達的影響

柳士博,張　艷，禮　海,朱潔潔

(1.撫順市中醫院,遼寧 撫順 113008；2.遼寧中醫藥大學附屬醫院,沈陽 110032；3.沈陽市第二中醫醫院，沈陽110101)

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·實驗研究·

益氣活血復方對動脈粥樣硬化家兔NF-κB基因表達的影響

柳士博1,張艷2*，禮海3,朱潔潔1

(1.撫順市中醫院,遼寧 撫順 113008；2.遼寧中醫藥大學附屬醫院,沈陽 110032；3.沈陽市第二中醫醫院，沈陽110101)

目的探討益氣活血復方對家兔頸總動脈球囊損傷模型CRP水平及NF-κB基因表達的影響。方法采用頸總動脈球囊損傷聯合高脂飼料喂養家兔的實驗方法。篩選家兔40只，隨機分為模型組、西藥對照組、治療組、正常組,共4組。各組家兔于8周末，清晨空腹經耳中央動脈采血,分離血漿。處死家兔后取頸總動脈組織，測定NF-κB基因表達。結果治療組、西藥對照組與模型組比較(P<0.01)，都能降低血漿CRP水平；與治療組比較，西藥對照組CRP水平下降更為明顯。治療組、西藥對照組均能下調NF-κB基因表達，但無統計學意義(P>0.05)，與正常組比較無統計學意義(P>0.05)。結論益氣活血復方能夠降低血漿CRP水平，下調NF-κB基因表達，具有明顯的拮抗炎癥反應的作用，有利于緩解動脈粥樣硬化的發生發展。

益氣活血復方；動脈粥樣硬化；NF-κB；CRP

動脈粥樣硬化(AS)導致最常見的器官病變是冠心病[1]。預防和治療動脈粥樣硬化是降低冠心病病死率，并提高患者預后及生活質量的有效途徑。益氣活血復方是恩師從醫多年的臨床經驗方，治療冠心病取得滿意臨床療效[2]。本實驗研究采用家兔高脂環境下的頸動脈內皮球囊損傷模型[3]，應用益氣活血復方干預,觀測其對動脈粥樣硬化家兔血漿CRP水平及NF-κB基因表達的影響[4]。旨在從分子生物學水平探討益氣活血復方對在體動物AS的干預作用。

1　材料

1.1實驗動物選取健康6月齡雄性新西蘭大耳白兔40只，體質量(2.48±0.35)kg。由遼寧中醫藥大學實驗動物中心提供，普通級。

1.2實驗藥物益氣活血復方由黃芪、當歸、桃仁、紅花等藥物組成。遼寧省中醫研究院劑型研究室制備，含4.87 g/g生藥。西藥對照藥：辛伐他汀片，10 mg/片(上海信誼萬象藥業股份有限公司生產，批號：061201)。膽固醇(天津市福晨化學試劑廠生產，批號：2040612)。

1.3試劑與儀器RT-PCR試劑盒：大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)，批號：Bk2201。DNA-marker DL2000：大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)，批號：CB3301。NF-κB、GAPDH內參照由寶生物工程(大連)有限公司合成。球囊導管及手推式壓力泵：美國Boston Scientific公司，MAV-MR 20 mmΧ20 mm,CE0197。全自動生化分析儀：日立7600型。低溫高速離心機：德國，型號HERAEUS BIOFUGE28R。PCR儀：美國PERKIN ELMER，型號PE9600。

2　方法

2.1動物分組及取材動物適應性喂養1周后，隨機分成2組。6只喂以標準兔飼料的正常對照組，34只喂以高膽固醇飼料的手術組。手術組34只新西蘭大耳白兔行頸總動脈球囊損傷術。4周后，完成頸總動脈球囊損傷術的動物根據血脂水平、動物體質量等指標，隨機分為模型組、西藥對照藥辛伐他汀組(西藥對照組)、益氣活血復方組(治療組)。由于在造模過程中死亡4只，所以模型組、西藥對照組、治療組每組各10只。加正常組，共4組。各給藥組在每天清晨只喂食藥物飼料，待吃完后，再加足高膽固醇飼料；模型組喂以高膽固醇飼料；正常組則只供普通飼料飼養。實驗組家兔每周稱體質量1次，根據體質量調整每只實驗動物的給藥量，共給藥4周。第8周末，處死所有家兔后，分離頸總動脈損傷血管段，正常組取其頸總動脈相對應處，結扎兩端后剪取放入DEPC處理彈頭管中，-80 ℃保存。

2.2給藥劑量辛伐他汀5 mg/(kg·d)，益氣活血復方顆粒1 g/(kg·d)。

2.3指標測定

2.3.1血漿CRP水平測定各組家兔于8周末，清晨空腹稱重后，經耳中央動脈采血4 mL，EDTA抗凝，分離血漿，-80 ℃保存。

2.3.2RT-PCR方法測定血管內皮(組織)中NF-κB基因表達1)血管壁總RNA提取、RT-PCR擴增反應:取動脈血管0.5 cm,按試劑盒說明操作。PCR反應參數：94 ℃變性3 min后進入循環,94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共30個循環,72 ℃延伸5 min。2)定量分析：取10 μL PCR反應產物，加入6×溴酚蘭上樣緩沖液2 μL后上樣，于配加了溴乙錠的2%的瓊脂糖凝膠上電泳,應用Bio-Rad Gel Doc 1 000成像系統采集實驗結果圖像，并用凝膠成像分析系統GIS120D對圖像條帶進行灰度掃描，以GAPDH為內參基準作半定量分析，測定樣本NF-κB基因的相對表達量。

3　結果

3.1各組家兔一般狀況比較正常組家兔一般狀況良好，被毛豐厚細密，富有光澤，皮膚緊密結實，門齒潔白整齊，耳長直立，精神飽滿，日常活動、飲水及采食積極，食欲佳。造模后家兔一般狀況欠佳，被毛粗糙無光澤，皮膚厚而松弛，日常活動量明顯減少，多靜伏，精神不振，食欲欠佳。在給藥的4周后，治療組、西藥對照組的家兔一般狀況明顯改善，精神轉佳，活動、采食頻繁。模型組一般狀況無明顯改善。

3.2各組家兔血漿CRP水平比較見表1。

1　各組家兔血漿C反應蛋白變化情況±s)

注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與治療組比較，▲P<0.05

3.3各組家兔NF-κB基因表達比較見表2。

表2　各組家兔動脈組織NF-κB mRNA表達的比較

注：與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

4　討論

中醫學將冠心病[5-10]歸屬于“胸痹”范疇，認為其以氣虛為本，血瘀為標，具有本虛標實的病理特點。追溯至《素問·陰陽應象大論》：“陰盛則陽病”“氣虛宜掣引之”的論述，氣屬陽血屬陰，本著“氣行則血行”“血實宜決之”扶正祛邪的原則，治以扶陽益氣為主，輔以活血化瘀，以達氣旺則血充，氣行則血暢，氣血調和之目的[11]。黃芪、當歸、桃仁、紅花是本實驗研究中益氣活血復方的主要組方藥物，具有顯著的補虛化瘀之功效。現代藥理實驗表明，黃芪總提取物在體外抗血栓形成、增強機體清除氧自由基能力及降低氧化應激反應等方面具有顯著作用[12]。當歸、川芎兩藥為臨床常見的配伍佳對，二者氣血兼顧，補而不滯，活血行血而性質柔潤。藥理學實驗也證實了兩者配伍可明顯增強血管內皮細胞的保護作用，降低血管阻力，提高機體的抗氧化活性[13]。紅花中含有高達85%的羥基紅花黃色素，能顯著改善冠狀動脈的血流動力學及凝血機制，延長APTT[14]，其與桃仁配伍具有極佳的活血化瘀功效。冠心病動脈粥樣硬化的形成即“血瘀證狀態”，其因炎癥累及所致的內皮損傷，心肌能量代謝的關鍵酶活性異常等因素均對AS的形成起促進作用[15]。

本實驗研究結果表明，益氣活血復方能夠降低血漿CRP水平，下調頸總動脈球囊損傷術后家兔NF-κB基因表達，NF-κB表達減少后，由之調控的有關炎性因子和生長因子的表達也會隨之降低，從而達到明顯的拮抗炎癥反應的作用。益氣活血復方可能是通過一系列復雜機制以影響Kappa-B激酶抑制劑的活性，使NF-κB無法通過細胞質進入到細胞核內，失去了與DNA結合的機會，最終實現降低NF-κB的表達，降低炎癥反應的目的[16]。由此可見，益氣活血復方具有明顯的防治動脈粥樣硬化的作用。與西藥相比療效相近，且具有不良反應少、毒性低的優點。本實驗可為益氣活血中藥防治動脈粥樣硬化提供科學的實驗依據。

[1]吳興碧.社區居民冠心病流行病學的調查分析[J].心血管病防治知識(下半月),2014(12):7-8.

[2]張艷,龐敏,胡曉紅.益氣活血復方防治PTCA術后再狹窄臨床體會[J].中華中醫藥學刊,2008,26(3):464-465.

[3]WILSON S H,SIMARI R D,BEST P J,et al.Simvastatin preserves coronary endothelial function in hypercholesterolemia in the absence of lipid lowering[J].Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology,2001,21(1):122-128.

[4]GUPTA S V,MCGOWEN R M,CALLEWAERT D M,et al.Quantitative chemiluminescent immunoassay for NF-kappaB-DNA binding activity[J].Journal of Immunoassay & Immunochemistry,2005,26(2):125-143.

[5]任建勛,李磊,林成仁,等.痰瘀同治方對小型豬冠狀動脈粥樣硬化炎癥反應的影響[J].中國中藥雜志,2014,39(2):285-290.

[6]MULVIHILL N T,FOLEY J B.Inflammation in acute coronary syn-droms[J].Heart,2002,87(3):201-204.

[7]BRIAN W,METCALF.Cellular adhesion,moleculat definition to therapeutic potential[M].new york:plenum press,1994.

[8]TAILOR A,COOPER D,GRANGER D N.Platelet-vessel wall interactions in the microcirculation[J].Microcirculation,2005,12(3):275-285.

[9]CHEN F-e,HUANG D-b,CHEN Y-q,et al.Crystal structure of p50/p65 heterodimer of transcription factor NF-kappaB bound to DNA[J].Nature,1998,391:410-413.

[10]楊俊,岳增輝,謝濤,等.動脈粥樣硬化易損斑塊與TLR4/NFκB信號通路關系的研究進展[J].中西醫結合心腦血管病雜志,2014,12(6):747-749.

[11]沈紹功,王承德,韓學杰.中醫心病治法大全[M].北京:中國中醫藥出版社,2005:8-9.

[12]張晶,王大新,何勝虎,等.卡托普利與黃芪對氧化損傷人臍靜脈內皮細胞保護作用的研究[J].中國臨床藥理學與治療學,2015,20(8):891-895.

[13]李國強,潘永福,方慶,等.當歸芍藥散含藥血清對ET-1誘導的HSC-T6細胞收縮的影響[J].中國臨床藥理學與治療學,2016,21(4):361-365.

[14]董文彬,葉小弟,程敏,等.羥基紅花黃色素A抗心肌缺學作用研究[J].中國臨床藥理學與治療學,2014,19(9):1001-1005.

[15]袁肇凱,簡維雄,黃獻平,等.基于冠心病血瘀證心肌細胞能量代謝網絡模型的平衡分析[J].湖南中醫藥大學學報,2016,36(2):20-24.

[16]邱媛媛,王偉恒,朱樑.炎癥因子在酒精性肝病發生發展中的作用[J].臨床肝膽病雜志,2016,32(3):574-578.

Yiqihuoxue compound on expression of atherosclerosis in rabbits NF-κB gene

LIU Shibo1,ZHANG Yan2*,LI Hai3,ZHU Jiejie1

(1.Fushun Hospital of Traditional Chinese Medicine,Fushun 113008,Liaoning Province,China;2.The Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110032,China;3.The Second Shenyang Hospital of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110101,China)

ObjectiveTo observing the effect of the formula of Supplementing Qi and activating blood circulation on the CRP level and the expression of NF- kappa B in the rabbit carotid artery balloon injury model,the effect mechanism of the prescription for supplementing qi and activating blood circulation in the treatment of atherosclerosis was discussed.MethodsCommon carotid artery injury combined with high-fat diet fed rabbits experimentally.Screening of 40 rabbits were randomly divided into model group,western medicine control group,the treatment group,plus the normal control group,a total of four groups of rabbits.Rabbits in each group of 8 weeks,fasting blood by ear central artery,plasma separated.Rabbits were sacrificed after taking carotid artery tissue,measuring gene expression NF-κB.ResultsTreatment group,western medicine group and the model group (P<0.01),can reduce plasma CRP levels;compared with the treatment group and comparison group CRP levels decreased more obvious.NF-κB gene therapy group,comparison group can be reduced,there was no significant difference (P>0.05),no difference (P>0.05) and the normal group.ConclusionYiqihuoxue compound capable of lowering plasma CRP levels,reduced NF-κB gene expression,has obvious antagonistic role of inflammation,and help alleviate the development of atherosclerosis.

Yiqihuoxue compound;atherosclerosis;NF-κB;CRP

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.05.006

遼寧省科技廳自然科學基金“益氣活血中藥防治PTCA術后再狹窄的臨床及實驗研究”(20062073)。

柳士博(1983-)，女，碩士研究生，主治中醫師，主要從事中西醫結合治療心血管病臨床研究。

張艷，女，主任醫師，博士研究生導師，電話-1388929805，電子信箱-Yanzhang1016@126.com

R285.5

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2095-6258(2016)05-0895-03

2016-05-24)