酸棗仁皂苷A對果蠅睡眠影響的量效關系與時效關系研究

劉曉巖，劉美玉，卞宏生，李廷利

(黑龍江中醫藥大學中藥藥理教研室，哈爾濱 150040)

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酸棗仁皂苷A對果蠅睡眠影響的量效關系與時效關系研究

劉曉巖，劉美玉，卞宏生，李廷利*

(黑龍江中醫藥大學中藥藥理教研室，哈爾濱 150040)

目的研究酸棗仁皂苷A對野生型CS品系果蠅睡眠作用影響的量效關系與時效關系。方法選擇野生型CS品系7 d齡雄性果蠅為研究對象,采用液體給藥的方式，利用果蠅活動監測系統，觀察不同濃度酸棗仁皂苷A對果蠅睡眠影響的量效關系和時效關系。結果1 mg/mL劑量為最佳給藥濃度，給藥3 d為最佳給藥時間，并可以明顯延長果蠅白天平均睡眠的總時間和夜晚平均睡眠的總時間，增強果蠅的片段化睡眠。結論酸棗仁皂苷A對野生型CS品系7 d齡雄果蠅的睡眠具有一定的改善作用。

酸棗仁皂苷A；果蠅；睡眠

酸棗仁是鼠李科棗屬植物酸棗的干燥成熟種子[1],具有補肝、寧心、斂汗、生津的功效。主治虛煩不眠、驚悸多夢、體虛多汗、津傷口渴等癥。酸棗仁的化學成分比較多[2-4]，目前已從酸棗仁中分離得到達瑪烷型三萜皂苷、三萜類化合物、黃酮類化合物、生物堿、脂肪油和各種維生素等活性化學成分，并有研究確定酸棗仁皂苷元有鎮靜催眠作用，酸棗仁皂苷A是酸棗仁中含量較高的有效成分之一。目前對此單體物質的藥理、毒理、構效關系、量效關系、譜效關系及臨床的研究還很少。

1　材料

1.1實驗動物野生型Canton S品系黑腹果蠅(Drosophila melnogaster)(由北京大學生命科學學院提供) 飼養于自動定時光控系統。實行每天12 h∶12 h的明暗光照周期處理，溫度(24±1)℃，相對濕度50%～60%，光照強度為400 lux[5-6]。

1.2藥物與試劑酸棗仁皂苷A，外觀為白色結晶粉末，HPLC≥98.60%，批號：MUST-15020411(成都曼思特生物科技有限公司中國科學院成都生物研究所)。蔗糖(分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20140111)；瓊脂(細菌學級，產地日本，批號：201501)；酵母粉(食品級，安琪酵母股份有限公司，批號：20150512)；玉米粉(食品級)。

1.3實驗儀器果蠅雌雄分離裝置(自制)果蠅活動監測系統(DAMS，USA.)；二氧化碳麻醉裝置(自制)；鑷子、毛筆、果蠅培養指管、脫脂棉。

2　方法

2.1培養基的配制

2.1.1果蠅基礎培養基的配制(用于果蠅的飼養)[7-8]準確量取蔗糖(31 g)、瓊脂(3 g)和蒸餾水(300 mL)，三者充分混勻攪拌，加熱煮沸至瓊脂完全熔化，形成A液體；準確量取玉米粉(42 g)與蒸餾水(160 mL)，兩者充分混勻攪拌，形成B液體；將A液體和B液體充分混勻，并不斷攪拌，煮沸至糊狀，停止加熱；待A、B糊狀混合液溫度降至60～70 ℃，加入酵母粉(3 g)，充分攪拌后，加入丙酸(3 mL)，攪拌均勻，立即分裝于潔凈的培養指管中，每管培養基厚度為1.5～2 cm，待培養基完全凝固后，將培養管倒置于操作室內，待完全冷卻凝固后即可使用。

2.1.2果蠅液體培養基配制(用于空白組)[9]準確量取2.5 g的蔗糖，置于50 mL燒杯內，加入50 mL的蒸餾水，不斷攪拌使其溶解均勻。用移液管移入10 mL容量瓶中定容，充分搖勻后備用(用于實驗空白組)。

2.1.3果蠅含藥培養基配制(用于給藥組)[10-12]首先配制5%的蔗糖溶液待用，準確量取酸棗仁皂苷A 2.5、5、10、20、40 mg，分別置于50 mL燒杯內，分別加入10 mL的5%的蔗糖溶液，移入10 mL容量瓶中定容，配制成不同劑量的溶液，分別為0.25、0.5、1、2、4 mg/mL，搖勻混合后備用。

2.2量效關系研究方法選擇7 d齡雄性果蠅為研究對象，收集12 h內剛羽化未交配的雄性果蠅，飼養6 d后，分為空白組和不同劑量給藥組，每組32只，將果蠅移入監測管中，適應6 h，啟動DAMS，記錄早7∶00到次日早7∶00果蠅24 h睡眠活動時間。

2.3時效關系研究方法選擇7 d齡雄性果蠅為研究對象，收集12 h內剛羽化未交配的雄性果蠅，飼養6 d后，給予量效關系實驗中最佳劑量，按照不同給藥天數分組，每組32只，將果蠅移入監測管中，適應6 h，啟動DAMS，記錄早7∶00到次日早7∶00果蠅24 h睡眠活動時間。

2.4統計學處理通過EXCEL軟件對實驗數據進行處理。采用SPSS 17.0統計軟件，2組以上比較時采用單因素方差分析方法進行數據處理，用LSD法進行兩兩比較；2組間比較時采用獨立樣本t檢驗法。P<0.05為有統計學意義。

3　結果

3.1酸棗仁皂苷A對果蠅鎮靜催眠作用的量效關系見表1。

表1　酸棗仁皂苷A對雄果蠅睡眠影響的量效關系±s)

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01

3.2酸棗仁皂苷A對果蠅鎮靜催眠作用的時效關系見表2。

實驗結果表明，給藥2 d后，果蠅的全體平均睡眠時間延長，白天睡眠時間沒有顯著性差異，而夜晚睡眠時間有顯著性差異。給藥3 d后，果蠅的白天和夜晚平均睡眠時間均明顯延長，均有極顯著性差異，P<0.01。給藥4 d后，果蠅的睡眠時間均縮短。故確定最佳的給藥天數為3 d。

表2　酸棗仁皂苷A對雄果蠅睡眠影響的時效關系±s)

注：與空白組比較，#P<0.05,##P<0.01

4　小結

通過果蠅的預實驗的前期工作,選擇了7 d齡果蠅作為觀察對象，并設計了5個酸棗仁皂苷A的給藥濃度，以監測管內液體給藥的方式進行酸棗仁皂苷A對果蠅睡眠影響作用的量效關系研究，擺脫了培養基給藥定量不準確的困擾，探索酸棗仁皂苷A對果蠅睡眠影響的最佳給藥劑量。并能通過睡眠覺醒的節律圖得到酸棗仁皂苷A對果蠅白天和夜晚睡眠片段化睡眠增強的影響[13-14],睡眠是一個復雜的生理過程[15]，前期研究證實，果蠅也有類似哺乳動物的睡眠樣狀態[16-17]，而果蠅一直都是基因研究領域最重要的模式生物之一，有著繁殖快，易于操作，基因明確的優勢，為后續利用分子生物學知識探求睡眠的機制提供了研究基礎。

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Dose-effect and time-effect of Jujuboside A in drosophila sleep

LIU Xiaoyan,LIU Meiyu,BIAN Hongsheng,LI Tingli*

(Traditional Chinese Medicine Pharmacology Teaching and Research Section,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China)

ObjectiveTo study the dose-effect and time-effect of Jujuboside A in drosophila sleep.MethodsThe 7-day-old male drosophila as the research object,with the method of liquid dosage,using drosophila activity monitoring system,observe the different concentration of Jujuboside A in drosophila a sleep affects the dose-effect and time-effect.ResultsThe dose of 1 mg/mL the best drug concentration,3 days as the best delivery time,and can obviously prolong drosophila,on average,the total time of sleep during the day and night,on average,the total time of sleep.Enhance the drosophila with fragmented sleep.ConclusionJujuboside A can improve the 7-day-old male drosophilas sleep time

Juiuboside A;drosophila;sleep

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.05.009

黑龍江中醫藥大學“優秀創新人才支持計劃”基金資助項目(2012RCL03)。

劉曉巖(1985-)，女，博士，講師，主要從事天然藥物生物活性與方法作用機理研究。

李廷利，博士，教授，電話-13804527211，電子信箱-ltlhlj@126.com

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2095-6258(2016)05-0905-03

2015-12-08)