野生蕨菜水提液對秀麗隱桿線蟲生理作用的影響研究

劉　靜，陳競適，任海姣，鄒婧澤，侯愛香

(1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，長沙　410128； 2湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，長沙　410128)

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野生蕨菜水提液對秀麗隱桿線蟲生理作用的影響研究

劉靜1，陳競適1，任海姣1，鄒婧澤2，侯愛香1

(1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，長沙410128；2湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，長沙410128)

探索了不同濃度蕨菜水提液對秀麗隱桿線蟲整個(gè)生命周期生物學(xué)功能的影響，對蕨菜水提液的毒理性作出合理評價(jià)。實(shí)驗(yàn)以秀麗隱桿線蟲為模式生物，通過給秀麗隱桿線蟲喂食0.1 mL 6種不同濃度(0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/mL)的蕨菜水提取液，觀察不同濃度蕨菜水提取液對其生理指標(biāo)(壽命、產(chǎn)卵數(shù)、運(yùn)動性、細(xì)胞凋亡)的影響。研究結(jié)果表明：蕨菜能對秀麗隱桿線蟲的生理指標(biāo)產(chǎn)生較大影響，具體表現(xiàn)為隨著蕨菜水提取液濃度增加，壽命逐漸縮短，產(chǎn)卵數(shù)逐漸減少，細(xì)胞凋亡數(shù)增加，三者均呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性，而對運(yùn)動性影響不大。

蕨菜；秀麗隱桿線蟲；壽命；產(chǎn)卵數(shù)；運(yùn)動性；細(xì)胞凋亡

蕨菜為蕨科多年生草本植物，我國主要集中在西北、華北、東北和西南，湖南省的蕨類資源特別豐富。20世紀(jì)80年代初，日本科學(xué)家在蕨菜中成功分離出“原蕨苷”(ptaquiloside)，并用它來喂動物，發(fā)現(xiàn)動物出現(xiàn)骨髓功能喪失、失明等癥狀，同時(shí)在生化實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)它還可以與氨基酸反應(yīng)，也可以破壞DNA。1999年證實(shí)蕨菜是唯一能使動物發(fā)生自然癌變的高等植物，且蕨菜中的主要致癌物質(zhì)為原蕨苷[1，2]。很多學(xué)者隨后開展了蕨菜致癌物的研究。有文獻(xiàn)表明，原蕨苷主要集中在蕨菜的新出現(xiàn)產(chǎn)囊絲鉤中，原蕨苷最高濃度可達(dá)到3.9 mg/g bm，最低為1.98 mg/g bm。隨著葉片的不斷生長，原蕨苷濃度會慢慢降低，但是尾狀核可留住較大濃度的有毒物質(zhì)[3]。牧場中牛羊食用暴露在地表的蕨菜后，可通過乳汁將毒性傳遞給人類，這種潛在的風(fēng)險(xiǎn)會給人類帶來健康威脅。在此種認(rèn)識下，很多人對待蕨菜的態(tài)度開始轉(zhuǎn)變，從以前的“供不應(yīng)求”到現(xiàn)在的“談蕨色變”。但上述國外文獻(xiàn)提到的研究調(diào)查，要么是直接喂食原蕨苷，要么是整株且長期大量采食。而蕨菜在國內(nèi)傳統(tǒng)的食用方式一般為現(xiàn)采后烹飪或腌制后烹飪，作為時(shí)令野菜佐餐采食量十分有限。且國內(nèi)外有大量對蕨菜功能物質(zhì)的提取和功能性驗(yàn)證方面的研究，如蕨菜多糖、黃酮類物質(zhì)在抗氧化等方面的積極作用，如于曙光等[4]對蕨菜粗多糖清除自由基的研究，還有陳乃富[5]對蕨菜中黃酮具有良好的抗氧化活性的研究。因此如何科學(xué)采食和加工蕨菜資源成為備受爭議的問題。

秀麗隱桿線蟲是第一個(gè)基因組完全被定序的多細(xì)胞真核生物。全部編碼基因中線蟲基因組約有35%的基因與人基因組同源[6，7]?，F(xiàn)已有很多研究以秀麗隱桿線蟲為模式生物，研究作用物對其致死率、壽命長短、運(yùn)動軌跡、產(chǎn)卵數(shù)等的影響，并建立了較為完善的毒物毒性評估體系，如李貞景等[8]利用秀麗隱桿線蟲的產(chǎn)卵數(shù)和致死率指標(biāo)對4種不同的中藥進(jìn)行毒理性評價(jià)。本研究以秀麗隱桿線蟲為研究對象，模擬人體攝入蕨菜飲食模型，以新鮮野生蕨菜水提取液為原料，研究在不同濃度蕨菜水提取液作用下秀麗隱桿線蟲生理指標(biāo)的變化情況，從而科學(xué)直觀地評價(jià)蕨菜汁對秀麗隱桿線蟲的作用規(guī)律，為蕨菜汁開發(fā)加工的可行性提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料新鮮野生蕨菜水提取液濃度分別為(1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 g/mL)、野生型秀麗隱桿線蟲(C.elegansthe Bristol strain N2)以及大腸桿菌OP50(EscherichiacoliOP50)均由東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院孔璐教授惠贈。

1.1.2試劑NGM培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、M9緩沖液[9]、吖啶橙溶液(AO)：分析純，美國Sigma公司試劑。

1.1.3儀器電熱恒溫培養(yǎng)箱(MJX-250B-Z型，上海博迅實(shí)驗(yàn)有限公司)、連續(xù)變倍體式顯微鏡(Motic SMZ-168型，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)、單人單面超凈工作臺(SW-CJ-1FD型，蘇州凈化儀器廠)、攪拌機(jī)(KB50SA型，佛山科順?biāo)芰想娖鲗?shí)業(yè)有限公司)、低速大容量多管離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、生化培養(yǎng)箱(SPX-250BS-Ⅱ，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.2方法

1.2.1新鮮蕨菜水提取液的制備100 g新鮮蕨菜與100 mL蒸餾水按1∶1混合榨汁5 min，汁液用8層紗布過濾，得到的濾液依照上述方法再過濾兩次至無明顯蕨菜殘?jiān)?。過濾3次后的濾液放入高速離心機(jī)中以5 000 r/min快速離心20 min，除去離心杯底濾渣得1.0 g/mL的新鮮蕨菜汁。將1.0 g/mL的蕨菜汁進(jìn)行梯度稀釋，配成濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8 g/mL的蕨菜汁，121 ℃高溫高壓殺菌20 min。

1.2.2E.coliOP50的培養(yǎng)取1支E.coliOP50凍存管在37 ℃水浴加熱下速溶，轉(zhuǎn)入預(yù)先殺菌的LB液體培養(yǎng)基，在37 ℃搖床中以120 r/min的速度恒溫培養(yǎng)12 h。

1.2.3秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)參照Brenner S[10]方法。

1.2.4秀麗隱桿線蟲的同期化處理將處于產(chǎn)卵期間的20條秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)移至NGM平板上培養(yǎng)6～8 h后挑出，將有蟲卵的NGM平板在22 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后可得到300～400條同期化線蟲。

1.2.5秀麗隱桿線蟲壽命的測定將同期化后處于L4期的秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)入加有0.1 mL不同濃度蕨菜水提取液和空白實(shí)驗(yàn)組(即不含蕨菜汁)的9 cm NGM培養(yǎng)基中，每組實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)為30條，每個(gè)濃度組包含3個(gè)平行組。此時(shí)記為壽命0d，此后每天探視線蟲，提供相同的培養(yǎng)環(huán)境，至線蟲死亡，記錄線蟲正常死亡的條數(shù)，除去逃跑和挑飛的線蟲條數(shù)計(jì)算得到其平均壽命。對線蟲死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)為對外部機(jī)械性刺激無應(yīng)答。

1.2.6秀麗隱桿線蟲產(chǎn)卵數(shù)的測定將同期化后處于L4期的秀麗隱桿線蟲分別挑至不同蕨菜水提取液濃度梯度和空白實(shí)驗(yàn)組的NGM培養(yǎng)基中，22 ℃給藥24 h后挑至新的只含E.coliOP50不含蕨菜原液的 NGM平板中。6個(gè)濃度實(shí)驗(yàn)組包含3個(gè)平行組，每個(gè)NGM平板放置1條線蟲，放置在22 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24 h轉(zhuǎn)移1次，直至秀麗隱桿線蟲產(chǎn)卵期結(jié)束，統(tǒng)計(jì)每條秀麗隱桿線蟲在產(chǎn)卵期的總產(chǎn)卵數(shù)。

1.2.7秀麗隱桿線蟲運(yùn)動性的測定將同期化后的L4期秀麗隱桿線蟲分別挑至含有0.1 mL不同蕨菜水提取液濃度梯度和空白實(shí)驗(yàn)組的NGM培養(yǎng)基中，每個(gè)平板內(nèi)1條線蟲，保證每個(gè)濃度均含有3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組。22 ℃給藥24 h后加入放置在顯微鏡低倍鏡頭下觀察，運(yùn)動速率是指在1 min內(nèi)秀麗隱桿線蟲的頭部擺動次數(shù)，彎曲度是指在20 s內(nèi)秀麗隱桿線蟲做一個(gè)完整正弦運(yùn)動的次數(shù)。

1.2.8秀麗隱桿線蟲細(xì)胞凋亡的測定準(zhǔn)備6個(gè)濃度的NGM平板，每組平板內(nèi)分別挑有20條經(jīng)同期化處理的秀麗隱桿線蟲，0.1 mL蕨菜汁劑量給藥72 h。用當(dāng)場配制的吖啶橙(75μg/mL)染色。

2　結(jié)果與討論

2.1不同濃度蕨菜水提取液對秀麗隱桿線蟲壽命影響分析

由圖1可得出，與直接喂食大腸桿菌OP50的空白組相比，涂有蕨菜汁的實(shí)驗(yàn)組均對秀麗隱桿線蟲的壽命起損害作用，且這種影響呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性，即隨著蕨菜水提取液濃度的不斷升高，秀麗隱桿線蟲的壽命隨之逐漸縮短，對線蟲的致死效應(yīng)增強(qiáng)。出現(xiàn)這種結(jié)果，可能是線蟲作為最簡單神經(jīng)系統(tǒng)的生物之一，一定濃度的蕨菜提取液能夠?qū)€蟲的神經(jīng)系統(tǒng)造成較大的損害，神經(jīng)系統(tǒng)是指導(dǎo)其正常的生理代謝的重要結(jié)構(gòu)，神經(jīng)系統(tǒng)的損害使正常代謝失去控制，造成代謝紊亂，縮短線蟲的壽命。在1.0 g/mL蕨菜汁培養(yǎng)下的秀麗隱桿線蟲壽命時(shí)間降低率為25.91%，說明高濃度的蕨菜水提取液具有較強(qiáng)的致死效應(yīng)。

圖1　不同濃度蕨菜水提取液對秀麗隱桿線蟲壽命的影響　　注：組分間用不同字母表示差異性顯著(P<0.05)；組分之間有1個(gè)字母相同則表示差異性不顯著，下同。

2.2不同濃度蕨菜水提取液對秀麗隱桿線蟲產(chǎn)卵數(shù)的影響分析

由圖2可看出，在不同濃度蕨菜水提取液喂養(yǎng)下，秀麗隱桿線蟲產(chǎn)卵數(shù)均低于空白實(shí)驗(yàn)組，說明秀麗隱桿線蟲的生殖能力受一定濃度的蕨菜水提取液影響，隨著蕨菜水提取液濃度的增加，該種損傷影響逐步增強(qiáng)。秀麗隱桿線蟲體內(nèi)染色體對數(shù)較少，有5對常染色體和1對性染色體，染色體數(shù)目相對較少，在一定蕨菜提取液的作用下能夠?qū)π匀旧w造成較大的傷害，可能導(dǎo)致部分生殖功能受損。且易得出在1.0 g/mL的最高給藥濃度下，對生殖能力的損害作用最強(qiáng)。

圖2　不同濃度蕨菜水提取液對秀麗隱桿線蟲產(chǎn)卵數(shù)的影響結(jié)果

2.3不同濃度蕨菜水提取液對秀麗隱桿線蟲運(yùn)動性的影響分析

由圖3、4可以看出，雖然彎曲度和運(yùn)動速率有些起伏，但整體在均值上下浮動，可認(rèn)為蕨菜汁對秀麗隱桿線蟲的運(yùn)動性沒有顯著影響，沒有濃度依賴性的規(guī)律特征出現(xiàn)。可以認(rèn)為線蟲通過消化道攝入蕨菜提取液，而線蟲的運(yùn)動主要是通過表皮收縮實(shí)現(xiàn)，因此并未對線蟲的運(yùn)動功能產(chǎn)生影響。

圖3　為不同濃度蕨菜水提取液液對秀麗隱桿線蟲運(yùn)動速率的影響結(jié)果

圖4　為不同濃度蕨菜水提取液液對秀麗隱桿線蟲彎曲度的影響結(jié)果

2.4不同濃度蕨菜水提取液對秀麗隱桿線蟲細(xì)胞凋亡的影響分析

由于DNA斷裂而增加的凋亡細(xì)胞經(jīng)吖啶橙染色處理后呈現(xiàn)黃色或橙色，正常細(xì)胞呈綠色，在熒光倒置顯微鏡下可觀察到明顯的綠色正常細(xì)胞[11]。由圖5 a-f可觀察出圖a綠光最強(qiáng)，隨著蕨菜水提取液濃度的不斷升高，綠光強(qiáng)度越來越弱，即秀麗隱桿線蟲體內(nèi)正常細(xì)胞越來越少，說明可能蕨菜提取液中存在某些促使線蟲DNA斷裂的毒性物質(zhì)，通過影響控制細(xì)胞凋亡的基因，來增加凋亡細(xì)胞數(shù)，從而縮短線蟲的壽命。與空白組對比，喂養(yǎng)蕨菜水提取液的線蟲綠光明顯較弱，凋亡細(xì)胞越來越多，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性。在1.0 g/mL濃度下，綠光強(qiáng)度最弱，蕨菜水提取液對秀麗隱桿線蟲的毒害作用達(dá)到最強(qiáng)。

0.0 g/mL

0.2 g/mL

0.4 g/mL

0.6 g/mL

0.8 g/mL

1.0 g/mL

3　討論與分析

3.1蕨菜水提液對秀麗隱桿線蟲壽命、產(chǎn)卵數(shù)和運(yùn)動性的影響

國內(nèi)已有多位學(xué)者對蕨菜進(jìn)行了深加工、功能性成分的提取和驗(yàn)證等方面的實(shí)驗(yàn)。許文濤等[12]通過調(diào)整不同的料水比、提取溫度和提取時(shí)間，結(jié)合響應(yīng)曲面法得出了蕨菜多糖的優(yōu)化提取參數(shù)，黃建韶等通過研究不同pH、溫度、底物濃度、抑制劑條件下對蕨菜中多酚氧化酶作用的影響來抑制蕨菜的褐變[13]。國外也有研究證明牛的上消化道的鱗狀細(xì)胞癌與蕨菜的慢性毒性有關(guān)[14]。

本研究所使用的蕨菜水提液為多物質(zhì)混合物，即整株蕨菜榨汁去渣水提所得，從研究看來，在低濃度范圍下，蕨菜汁對秀麗隱桿線蟲的影響不大，如在0.2 g/mL濃度下，運(yùn)動性幾乎無變化，壽命和產(chǎn)卵數(shù)的影響也不大。但隨著濃度增加，壽命和產(chǎn)卵數(shù)均呈現(xiàn)較為明顯的下降，在1.0 g/mL的最高濃度下較空白實(shí)驗(yàn)組下降百分比分別為25.91%和76.34%。所以采食要注意量的把握，過量會對人體產(chǎn)生較大的損害，但對有毒物質(zhì)在水溶液中所占的具體百分比還有待下一步研究。在對運(yùn)動性的研究中，不同濃度蕨菜水提取液并未對秀麗隱桿線蟲的運(yùn)動系統(tǒng)功能產(chǎn)生影響，可能是蕨菜水提取液通過消化道被吸收到線蟲體內(nèi)，并未對線蟲運(yùn)動系統(tǒng)造成損害，從而不能引起其運(yùn)動能力的降低。但是在對秀麗隱桿線蟲壽命和產(chǎn)卵數(shù)的研究中，二指標(biāo)均在高濃度蕨菜水提取液的作用下，較空白組降低幅度較大，說明蕨菜水提取液可以損害秀麗隱桿線蟲細(xì)胞內(nèi)的基因結(jié)構(gòu)，對生殖能力的損害更為顯著，且毒理性作用呈現(xiàn)較為明顯的濃度依賴特征。

3.2蕨菜水提液對秀麗隱桿線蟲細(xì)胞凋亡的影響

秀麗隱桿線蟲體內(nèi)的細(xì)胞凋亡水平隨著蕨菜水提取液濃度的增加而提高，喂有1.0 g/mL蕨菜汁的實(shí)驗(yàn)組內(nèi)細(xì)胞凋亡水平達(dá)到最高。細(xì)胞凋亡是主動過程，它是通過激活一系列基因進(jìn)行表達(dá)以及調(diào)控，從而爭取主動死亡的過程。在高濃度蕨菜水提取液下，細(xì)胞主動死亡的過程加強(qiáng)說明蕨菜中的某些物質(zhì)可能刺激到秀麗隱桿線蟲的細(xì)胞凋亡基因從而實(shí)現(xiàn)大部分細(xì)胞程序性死亡的現(xiàn)象。在分子層面上隨著蕨菜水提取液濃度增加，細(xì)胞凋亡數(shù)增多，更好地印證了在個(gè)體層面上壽命縮短的情況，由圖五的綠色熒光強(qiáng)度即可看出，正常細(xì)胞越多，綠色熒光越強(qiáng)，反之則說明體內(nèi)正常細(xì)胞較少。在1.0 g/mL蕨菜水提取液濃度喂養(yǎng)下的秀麗隱桿線蟲體內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度達(dá)到最低，代表此時(shí)線蟲體內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)最多。結(jié)合個(gè)體層面上，秀麗隱桿線蟲在不同濃度蕨菜水提取液飼養(yǎng)情況下壽命和產(chǎn)卵數(shù)的變化，其作用規(guī)律表現(xiàn)出較為顯著的濃度依賴性，可以說明蕨菜水提取液能夠作用于線蟲細(xì)胞的凋亡信號通路從而實(shí)現(xiàn)促進(jìn)凋亡、縮短壽命的毒性功能。同時(shí)產(chǎn)卵數(shù)的減少可能是蕨菜水提取液對秀麗隱桿線蟲的生殖腺細(xì)胞產(chǎn)生了影響，導(dǎo)致大批量生殖腺細(xì)胞開始程序性死亡從而無法進(jìn)行產(chǎn)卵行為的結(jié)果。但本實(shí)驗(yàn)對蕨菜中有毒理性作用的物質(zhì)并未進(jìn)行深入探究，可以作為未來的研究方向，使蕨菜得到更為合理的利用與發(fā)展。

4　結(jié)論

本研究模擬人類飲食習(xí)慣，將蕨菜加水整株榨汁后，以其水提液喂養(yǎng)秀麗隱桿線蟲，試驗(yàn)結(jié)果顯示，這樣處理的蕨菜水提液對秀麗隱桿線蟲的生殖系統(tǒng)和細(xì)胞凋亡機(jī)制都有一定的影響。一方面，對蕨菜僅采取去除根部的加工或食用方法，輔以高溫殺菌或高溫烹飪也未能有效去除蕨菜的有毒物質(zhì)，原蕨苷等其他有毒物質(zhì)不可避免地被攝入；另一方面，對蕨菜采用榨汁水提處理的方式，也并未有效去除原蕨苷等有害物質(zhì)，說明部分有害物質(zhì)可能為水溶性的。因此，在后續(xù)的研究中，可采取去除根和蕨菜產(chǎn)囊絲鉤部分的蕨菜榨汁水提，進(jìn)一步研究蕨菜的處理方式和毒理特性之間的聯(lián)系?！?/p>

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(責(zé)任編輯李燕妮)

Physiological Effects of Wild Pteridium aquilinum Water Extract on Caenorhabditis elegans

LIU Jing1，CHEN Jing-shi1，REN Hai-jiao1，ZOU Jing-ze2，HOU Ai-xiang1

(1College of Food Science and Technology，Hunan Agricutural University，Changsha 410128，China；2College of Plant Protection，Hunan Agricutural University，Changsha 410128，China)

To investigate the effect of different concentrations ofPteridiumaqulinumionCaenorhabditiselegansin the whole life，macle a proper comment on the toxic properties of it.This experiment selectedCaenorhabditiselegansas a model organism in order to find the impact of different concentrations ofPteridiumaqulinumion the physiological(life-span，eggs laying，motility，apoptosis)signs ofCaenorhabditiselegansby feeding the volume of 0.1 mL from six kinds of concentrations which were 0.0，0.2，0.4，0.6，0.8 and 1.0 g/mL respectively.The results showed thatPteridiumaqulinumiexactly had the capability of affecting the index of physiological.With the rising concentration，mean life-span decreased，reproductive output decreased and apoptosis increased were observed，all the changes appeared in concentration-dependent，but there came to be ineffective about its apoptosis.

Pteridiumaqulinumi；Caenorhabditiselegans；life-span；eggs laying；motility；apoptosis

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)2015年大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目(項(xiàng)目編號：XCX1519)。

劉靜(1996—)，女，在讀本科，研究方向：食品微生物技術(shù)。

侯愛香(1982—)，女，講師，研究方向：食品微生物技術(shù)。