降糖消渴顆粒對自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠肝臟功能和氧化應(yīng)激的影響

張　毅　穆倩倩　于　娜　趙丹丹　左加成　安　宏　馬　越　莫芳芳　高思華

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029)

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降糖消渴顆粒對自發(fā)性2型糖尿病KKAy小鼠肝臟功能和氧化應(yīng)激的影響

張毅穆倩倩于娜趙丹丹左加成安宏馬越莫芳芳高思華

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029)

目的：探討降糖消渴顆粒對高脂飲食誘導(dǎo)的2型糖尿病KKAy小鼠肝臟功能和氧化應(yīng)激的影響。方法：30只KKAy小鼠予以高脂飼料喂養(yǎng)4周后，建立2型糖尿病(空腹血糖≥13.9 mmol/L)小鼠模型。將成模后的KKAy小鼠隨機分為模型組、吡格列酮組、降糖消渴顆顆粒高、中、低劑量組(1.75，3.5，7 g/kg)，6只C57BL/6J鼠為正常對照組。干預(yù)10周后，檢測小鼠血清中ALT、AST、γ-GT、SOD、MDA含量；取肝臟組織勻漿，檢測肝臟組織中MDA、SOD、GSH的含量。結(jié)果：降糖消渴顆粒低劑量(1.75 g/kg)可降低血清ALT、γ-GT、MDA水平并提高SOD活性(P<0.01)，但對肝臟中氧化應(yīng)激指標無明顯改善作用；中、高劑量(3.5，7 g/kg)均可顯著降低血清ALT、γ-GT，減少血清及肝臟MDA含量，提高SOD活性(P<0.01)，肝臟GSH活性也有所增強(P<0.05)。高劑量還具有降低血清AST的作用(P<0.01)。結(jié)論：降糖消渴顆粒可以有效改善T2DM狀態(tài)下肝臟的功能和氧化應(yīng)激狀態(tài)。

降糖消渴顆粒；2型糖尿病；肝臟功能；氧化應(yīng)激

隨著人們生活質(zhì)量的提高，糖尿病(DM)發(fā)病率持續(xù)走高，其中2型糖尿病(T2DM)患者占DM總?cè)藬?shù)的90%以上，而其主要發(fā)病原因是胰島素抵抗導(dǎo)致的糖脂代謝紊亂。肝臟作為機體糖脂代謝的重要器官之一，在T2DM狀態(tài)下的病理存在形式主要為非乙醇性脂肪性肝病(NAFLD)[1-2]。導(dǎo)致這一損傷的機制可能是高脂高糖內(nèi)環(huán)境下，肝細胞內(nèi)抗氧化酶活性降低，產(chǎn)生過量的氧自由基(ROS)和氮自由基(RNS)，超過細胞自身的氧化還原能力，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致線粒體失活酶活力減低，肝細胞脂肪酸氧化能力受損，造成細胞的損傷[3-4]。

降糖消渴顆粒是以中醫(yī)整體觀為辨證論治思想，以肝脾腎3臟同調(diào)理論為指導(dǎo)，并結(jié)合現(xiàn)代中藥炮制方法而創(chuàng)制的治療DM的方劑，經(jīng)前期基礎(chǔ)研究和臨床實踐證實具有良好的改善胰島素抵抗、降糖、降脂等作用[5]。本研究選用自發(fā)性T2DMKKAy小鼠為研究對象，予以高脂飼料喂養(yǎng)，模擬人類T2DM發(fā)病原因，探討降糖消渴顆粒對DM小鼠肝臟功能及氧化應(yīng)激的影響。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物KKAy小鼠，雄性，8周齡，28～32 g，購自北京華阜康生物科技有限公司，許可證號SCXK(京)2012-0001。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)屏障環(huán)境動物實驗室，合格證號SCXK(京)2011-0024，環(huán)境溫度22～24 ℃，相對濕度(40±10)%，12/12光照/黑暗循環(huán)。普通飼料及高脂飼料(20%蔗糖、2.5%膽固醇、10%豬油、1%膽酸鈉、66.5%基礎(chǔ)飼料)購自北京華阜康生物科技有限公司。

1.1.2儀器貝克曼全自動生化分析儀(美國Beckman公司)，BMG全波長酶標儀(德國BMG LABTECH公司)，IKA高速組織勻漿機(德國IKA公司)，分析天平。

1.1.3藥物降糖消渴顆粒(丹參、生地黃、黃連、茯苓、山茱萸、生曬參等10味藥依6∶6∶3∶3∶2∶2…比例組成)飲片購于河北安國藥材批發(fā)市場，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥科技發(fā)展部鑒定為正品，并制成顆粒，每克含5.01 g生藥。用時以蒸餾水配制相應(yīng)濃度的混懸液。鹽酸吡格列酮片(北京太平洋藥業(yè)有限公司)。

1.1.4試劑脂質(zhì)氧化測定試劑盒，總SOD活性檢測試劑盒(WST-8法)，GSH和GSSG檢測試劑盒，均購自碧云天生物技術(shù)研究所。RIPA裂解液(Solarbio，批號：20150122)。

1.2實驗方法

1.2.1動物模型制備KKAy小鼠36只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后給予高脂飼料飼養(yǎng)。C57BL/6J小鼠6只作為正常對照組，普通飼料喂養(yǎng)。KKAy小鼠高脂飼養(yǎng)4周后，禁食12 h后檢測空腹血糖(FBG)，以FBG≥13.9 mmol·L-1為DM小鼠標準，成模率100%。

1.2.2分組及給藥方法將成模后的DM小鼠按血糖，體重隨機分為模型組，陽藥組，降糖消渴顆粒高、中、低劑量組，每組6只。中藥治療各組灌胃給予等體積，不同濃度中藥，陽藥組予6.5 mg/kg吡格列酮，模型組和正常組予等體積蒸餾水灌胃。實驗期間于每日上午灌胃一次，T2DM小鼠予高脂飼料飼養(yǎng)，正常組小鼠予普通飼料飼養(yǎng)，共給藥10周。

1.2.3血清中相關(guān)指標檢測給藥10周后稱取動物體重并記錄，麻醉后腹主動脈取血，離心，取上層血清檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)，天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)，丙二醛(MDA)，超氧化物歧化酶(SOD)。

1.2.4肝臟中相關(guān)指標檢測摘除肝臟，4 ℃預(yù)冷生理鹽水沖洗后濾紙吸干，取相同部位肝組織，置于預(yù)冷的RIPA裂解液中，冰浴勻漿為10%的勻漿液。4 ℃，3 000 r/min離心15 min，取上清液按照試劑盒說明書測定肝臟MDA含量。肝臟SOD、還原型谷胱甘肽(GSH)測定方法同上。

2　結(jié)果

2.1降糖消渴顆粒對T2DM小鼠肝臟功能的影響高脂飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)的T2DMKKAy小鼠肝臟功能相關(guān)指標較正常小鼠顯著升高(P<0.01)。給藥10周后，吡格列酮與降糖消渴顆粒各劑量(1.75 g/kg，3.5 g/kg，7 g/kg)均可顯著降低肝臟ALT、γ-GT含量(P<0.01)，吡格列酮和高劑量(7 g/kg)降糖消渴顆粒可有效降低血清AST含量(P<0.01)，低、中劑量組小鼠血清AST未見明顯改善(P>0.05)，提示使用藥物控制DM的進程可以在一定程度上減輕肝細胞的損傷。降糖消渴顆粒對肝功相關(guān)指標的改善呈現(xiàn)出劑量依賴性關(guān)系的趨勢，高劑量(7 g/kg)效果最佳。見表1。

表1　降糖消渴顆粒對T2DM小鼠肝臟功能的影響±s)

注：與正常組比較*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較△P<0.05，△△P<0.01。

2.2降糖消渴顆粒對T2DM小鼠血清MDA、SOD的影響高脂飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)的T2DMKKAy小鼠血清中MDA含量顯著高于正常組(P<0.01)，而SOD活性較正常組低(P<0.01)。給藥10周后，吡格列酮有效的降低了血清MDA(P<0.01)含量且提高了SOD活性(P<0.01)。降糖消渴顆粒各劑量(1.75 g/kg，3.5 g/kg，7 g/kg)均明顯改善了血清MDA、SOD，以中劑量(3.5 g/kg)效果最佳。見表2。

2.3降糖消渴顆粒對T2DM小鼠肝臟MDA、SOD、GSH的影響高脂飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)的T2DMKKAy小鼠肝臟中MDA含量較正常組顯著升高(P<0.01)，SOD、GSH活性則較正常組降低。給藥10周后，吡格列酮組小鼠GSH活性有所升高(P<0.05)，而MDA含量和SOD活性與模型組小鼠比較未見統(tǒng)計學(xué)意義。低劑量(1.75 g/kg)降糖消渴顆粒對肝臟氧化應(yīng)激沒有明顯改善作用，中、高劑量(3.5 g/kg，7 g/kg)降糖消渴顆粒可顯著降低肝臟中MDA含量(P<0.01)，提高SOD活性(P<0.01)，且GSH活性也較模型組小鼠有所提高(P<0.05)。高劑量效果稍優(yōu)于中劑量，但無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

表2　降糖消渴顆粒對T2DM小鼠血清MDA、SOD的影響

注：與正常組比較*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較△P<0.05，△△P<0.01。

表3　降糖消渴顆粒對T2DM小鼠肝臟MDA、SOD、GSH的影響

注：與正常組比較*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較△P<0.05，△△P<0.01。

3　討論

T2DM條件下的肝臟病變主要表現(xiàn)為NAFLD，1998年Day等提出的“二次打擊”學(xué)說[6]闡明了其病理機制：在胰島素抵抗情況下，肝細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積導(dǎo)致脂肪肝的形成；活化的內(nèi)源性損害因子通過氧化應(yīng)激使反應(yīng)性活性氧(ROS)增多，導(dǎo)致肝細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化增強，線粒體功能受損，細胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)，肝損傷進一步加劇[7-8]。MDA是ROS與細胞膜磷脂中的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，是評價機體氧化應(yīng)激發(fā)生的重要指標[9]。

DM是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的病名，傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)并無此名，而多將此類疾病歸屬于“消渴”范疇。中醫(yī)辨證多屬肝脾腎三臟功能失常，以某一臟失調(diào)為主，漸次波及其余兩臟，且多虛實夾雜，氣陰兩虛挾氣滯、血瘀、濕(痰)凝、熱結(jié)[10]。臨床治療當扶正兼顧祛邪，恢復(fù)肝脾腎三臟功能。降糖消渴顆粒是結(jié)合現(xiàn)代DM的發(fā)病特點，立足肝脾腎，3臟同調(diào)而創(chuàng)制的系列方之一，本方以地黃湯為底方加減變化，滋腎榮肝，涼血活血且兼補血，同時健脾滲濕，更以黃連清熱瀉火[11]。

本實驗中DM小鼠血清和肝臟中MDA含量都較正常組顯著升高，說明高脂飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)的T2DM小鼠體內(nèi)發(fā)生了明顯的氧化應(yīng)激，而ALT、AST的升高則說明DM小鼠肝細胞受損，這可能是由氧化應(yīng)激導(dǎo)致的。經(jīng)過降糖消渴顆粒給藥治療后，各組小鼠肝臟中氧化應(yīng)激的水平都得到了不同程度的減輕。在改善肝功方面，降糖消渴顆粒呈現(xiàn)出劑量依賴性趨勢，高劑量(7 g/kg)較中、低劑量更能明顯降低血清中ALT、AST含量，對肝細胞保護作用較強；在改善血清及肝臟中氧化應(yīng)激指標方面，中、高劑量(3.5，7 g/kg)降糖消渴顆粒都具有明顯優(yōu)勢，這說明降糖消渴顆粒可在一定程度上降低DM狀態(tài)下肝細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激，提高體內(nèi)抗氧化酶活性，減輕肝細胞損傷，從而起到保護肝臟的作用。而降糖消渴顆粒發(fā)揮這一作用的機制是本身作為一種抗氧化劑，糾正機體氧化失衡狀態(tài)，還是通過改善胰島素抵抗狀態(tài)從而減輕肝細胞炎性反應(yīng)，仍需進一步研究。

綜上所述，降糖消渴顆粒對DM狀態(tài)下的肝臟損傷具有一定的保護作用，其作用可能是通過增強肝細胞抗氧化能力實現(xiàn)的。

[1]Saponaro C，Gaggini M，Gastaldelli A.Nonalcoholic fatty liver disease and type 2 diabetes：common pathophysiologic mechanisms[J].Curr Diab Rep，2015，15(6)：607.

[2]Zhou X，Xu J，Shi Y，et al.Discovery of Novel Anti-Diabetic Drugs by Targeting Lipid Metabolism[J].Curr Drug Targets，2015.

[3]Chambel S S，Santos-Goncalves A，Duarte T L.The Dual Role of Nrf2 in Nonalcoholic Fatty Liver Disease：Regulation of Antioxidant Defenses and Hepatic Lipid Metabolism[J].Biomed Res Int，2015：597134.

[4]Yilmaz B，Sahin K，Bilen H，et al.Carotenoids and non-alcoholic fatty liver disease[J].Hepatobiliary Surg Nutr，2015，4(3)：161-171.

[5]Zhao D D，Yu N，Li X K，et al.Antidiabetic and antioxidative effect of jiang tang xiao ke granule in high-fat diet and low-dose streptozotocin induced diabetic rats[J].Evid Based Complement Alternat Med，2014：475192.

[6]蘇劍鋒,江偉.“二次打擊”對非酒精性脂肪肝的影響[J].華夏醫(yī)學(xué),2015，28(2):141-144.

[7]Gusdon A M，Song K X，Qu S.Nonalcoholic Fatty liver disease：pathogenesis and therapeutics from a mitochondria-centric perspective[J].Oxid Med Cell Longev，2014：637027.

[8]Besse-Patin A，Estall J L.An Intimate Relationship between ROS and Insulin Signalling：Implications for Antioxidant Treatment of Fatty Liver Disease[J].Int J Cell Biol，2014：519153.

[9]牟忠卿,李曉博,陳麗.糖尿病大鼠肝臟組織中氧化應(yīng)激標志物的表達變化及意義[J].山東醫(yī)藥,2015，55(7)：26-28.

[10]高思華.以中西醫(yī)結(jié)合理論為指導(dǎo)，立足肝脾腎辨治糖尿病[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,1994,14(10):622-623.

[11]高思華,龔燕冰,倪青,等.肝脾腎同治法辨證治療2型糖尿病的臨床研究[J].中華中醫(yī)藥雜志.2009,24(8):1007-1010.

(2015-10-11收稿責(zé)任編輯：徐穎)

Effect of Jiangtang Xiaoke Granule on Hepatic Function and Oxidative Stress in Type 2 Diabetic KKAy Mice

Zhang Yi, Mu Qianqian, Yu Na, Zhao Dandan, Zuo Jiacheng, An Hong, Ma Yue, Mo Fangfang, Gao Sihua

(Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China)

Objective: To investigate the effect of Jiangtang Xiaoke granule (JTXKG) on hepatic function and oxidative stress in type 2 diabetic KKAy mice. Methods: A total of 30 KKAy mice were fed by high-fat-diet for 4 weeks, T2DM model were established by FBG≥11.1 mmol·L-1. The T2DM mice were then randomly divided into model group, pioglitazone group and JTXK granule groups in low (1.75 g/kg), medium (3.5 g/kg), and high (7 g/kg) doses. The normal group had 6 C57BL/6J in it. After 10-week treatment, the serum ALT, AST, γ-GT, MDA, SOD and hepatic MDA, SOD, GSH were measured. Results: Compared with model group, T2DM mice supplemented with 1.75 g/kg dose of JTXK granule has lower serum ALT, γ-GT, MDA (P<0.01) and higher SOD activity (P<0.05). However, it has little effect on hepatic oxidative stress index. T2DM mice fed with 3.5 and 7 g/kg dose of JTXK granule has lower serum ALT, γ-GT, serum and hepatic MDA and higher SOD, GSH activities significantly (P<0.01). Conclusion: JTXKG can improve hepatic function and oxidative stress in T2DM mice.

Jiangtang Xiaoke granule; Type 2 diabetes; Hepatic funciton; Oxidative stress

重大新藥創(chuàng)制(編號：2012ZX09103201-005)；科學(xué)研究與研究生教育-科學(xué)研究與科研基地建設(shè)項目-治療代謝綜合征創(chuàng)新中藥臨床前研究(編號：1000062520025)

張毅(1986.03—)，女，博士研究生在讀，研究方向：中醫(yī)藥防治糖尿病，E-mail：yicando@163.com

高思華(1957.07—)，男，博士，教授，研究方向：中醫(yī)藥防治內(nèi)分泌代謝性疾病，E-mail：gaosihua1216@163.com

R242;R285;R587.1

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.09.053