黑果枸杞中一種花色苷類物質的分離純化及抗氧化活性

唐驥龍，閆亞美，*，曹有龍*，曾曉雄，孫 怡，胡 冰，周 莉

（1.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095；2.國家枸杞工程技術研究中心，寧夏 銀川 750004）

黑果枸杞中一種花色苷類物質的分離純化及抗氧化活性

唐驥龍1，閆亞美1，2，*，曹有龍2，*，曾曉雄1，孫 怡1，胡 冰1，周 莉1

（1.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095；2.國家枸杞工程技術研究中心，寧夏 銀川 750004）

以黑果枸杞為原料，利用?KTA Purifier蛋白純化系統分離純化得到1 種純度97%以上的花色苷物質。通過質譜和核磁共振分析，鑒定該花色苷物質為矮牽牛素3-O-蕓香糖（反式-香豆?；?5-O-葡萄糖苷（petunidin 3-O-［rhamnopyranosyl-（trans-p-coumaroyl）］-5-O-（β-D-glucopyranoside）。體外抗氧化活性分析表明該花色苷物質具有顯著的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力。

黑果枸杞；花色苷；純化；結構鑒定；抗氧化活性

唐驥龍， 閆亞美， 曹有龍， 等. 黑果枸杞中一種花色苷類物質的分離純化及抗氧化活性［J］. 食品科學， 2016， 37（15）: 113-117. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615019. http://www.spkx.net.cn

TANG Jilong， YAN Yamei， CAO Youlong， et al. Purification and antioxidant activity of an anthocyanin from Lycium ruthenicum Murray［J］. Food Science， 2016， 37（15）: 113-117. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615019. http://www.spkx.net.cn

天然花色苷類色素在自然界分布廣泛且安全無毒，大量體內外研究表明花色苷具有較強的抗氧化活性，主要表現在抗炎、保護心血管、抗腫瘤等方面［1-3］。黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murray）為茄科（Solanceae）枸杞屬（Lycium L.）植物，果實黑色，是近年來新發掘的多年生耐鹽、抗旱野生枸杞資源，主要分布于寧夏、新疆、西藏、青海、內蒙、甘肅等地。黑果枸杞成熟漿果中富含花色苷，花色苷的功效作用及營養價值特別是其抗氧化及防治心腦血管疾病的功效，已被社會公眾所認同和接受，成為研究的熱點［4-7］。

花青素化合物屬于黃酮類物質，Castaneda-Ovando等［8］報道了在自然界天然色素通常為天竺葵色素（pelargonidin）、矢車菊色素（cyanidin）、飛燕草色素（delphinidin）、芍藥花色素（peonidin）、矮牽牛花色素（petunidin）以及錦葵色素（malvidin）。李進［9］、李淑珍［10］等對黑果枸杞色素的提取和精制工藝進行了研究，得到以體積分數80%的乙醇（酸性）能較好地提取黑果枸杞色素，并篩選出AB-8大孔樹脂能較好地分離黑果枸杞中的花色苷類物質。閆亞美等［6］通過體外抗氧化實驗得出黑果枸杞中的花色苷具有較強的抗氧化活性。Zheng Jie等［1］利用高效液相色譜電噴霧串聯質譜（high performance liquid c hromatography-electrospray ionizationmass spectrometry，HPLC-ESI/MS）分離并檢測了黑果枸杞中的花色苷并初步分析了其結構和抗氧化活性，Jin Hongli等［11-12］利用XCharge C8SAX色譜柱有效地分離出黑果枸杞中同種花色苷的順反結構單體?；谇捌谘芯炕A，本研究通過帶二極管矩陣檢測器的高效液相色譜（high-performance liquid chromatography-diode array detector，HPLC-DAD）分析黑果枸杞花色苷的組成，參考苦丁茶中咖啡酰類物質的分離純化方法［13］，利用?KTA Purifier蛋白純化系統分離純化黑果枸杞花色苷中主要的矮牽牛花色苷；通過質譜（mass spectrometry，MS）、核磁共振儀（nuclear magnetic resonance，NMR）解析其結構，并通過體外抗氧化實驗分析其抗氧化活性。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

黑果枸杞鮮果，采摘于寧夏銀川國家枸杞工程技術研究中心資源圃并于-20 ℃環境下保存。

AB-8大孔吸附樹脂 南開大學化工廠；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）、氯化硝基四氮唑藍（nitroblue tetrazolium，NBT）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）美國Sigma公司；乙腈、甲醇和甲酸（色譜純） 江蘇漢邦科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2儀器與設備

BL-220H分析天平 日本島津公司；真空旋轉蒸發儀 德國Heidolph公司；冷凍干燥機 美國Labconco公司；Synergy-2酶標儀 美國BioTek公司；Agilent 1100型高效液相色譜儀（包括G1311A 四元泵、G1379A真空脫氣機、G1316A 柱溫箱、G1315BDAD和化學工作站）、Agilent G24450型HPLC-ESI/MS 美國Agilent公司；TSKgel ODS-80 TsQA色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 日本Tosoh公司；YMC-PACK ODS-A色譜柱（20 mm×250 mm，5 μm） 日本YMC公司；?KTA Purifi er蛋白純化系統 美國通用電氣公司；Bruker DRX Avance核磁共振儀（500 MHz） 德國Bruker公司；DHL-B電腦恒流泵、DBS-100電腦全自動部分收集器上海青浦滬西儀器廠。

1.3實驗方法

1.3.1黑果枸杞花色苷粗提物的制備

準確稱量20 g黑果枸杞鮮果以料液比1∶40（m/V）加入體積分數80%乙醇（含體積分數0.1%甲酸）800 mL，50 ℃水浴浸提3 h后用濾紙過濾，將濾液用真空旋蒸儀旋蒸，旋蒸溫度為45 ℃，基本旋干后用體積分數0.5% TFA溶液定容至10 mL。參照Xi Lishan等［14］方法，將10 mL旋蒸液上樣于AB-8大孔樹脂層析柱（5 cm×30 cm），先通過去離子水洗脫兩個柱體積，再用體積分數95%（pH 2.0）的乙醇溶液洗脫，流速控制在2 mL/min，收集顏色較深的洗脫液并用真空旋蒸儀旋干，用含0.1% TFA溶液稀釋至50 mL即得到黑果枸杞花色苷粗提物。

1.3.2花色苷單體的制備

將花色苷粗提物經0.45 μm微孔膜過濾后，利用?KTA純化系統制備花色苷單體。YMC-PACK ODS-A色譜柱，檢測波長為280 nm，每管收集5 mL；洗脫液流動相：體積分數4%甲醇+19%乙腈+1%甲酸溶液，流速2 mL/min，通過紫外檢測器的實時監測并收集洗脫液，多次上樣，富集出峰時間相同的物質，用HPLC分析出純度較高的組分，將其合并、濃縮并冷凍干燥。

1.3.3HPLC-DAD分析

使用Agilent 1100 HPLC系統，檢測器DAD，色譜柱TSKgel ODS-80 TsQA，柱溫35 ℃，檢測波長530 nm和280 nm，進樣體積20 μL；采用梯度洗脫，流動相A：體積分數1%甲酸+0.1% TFA溶液，流動相B：體積分數15%甲醇-乙腈溶液，梯度洗脫條件如下：0 min 15% B，10 min 30% B，20 min 50% B，流速控制在0.6 mL/min。

1.3.4HPLC-DAD/MS檢測

用去離 子水溶解適量花色苷單體，過0.45 μm微孔濾膜，即為分析用液。HPLC分析條件同上。質譜條件：ESI，正離子檢測，掃描范圍m/z 0～2 000，霧化氣體為氮氣，流速為2 mL/min，電離電壓為4.5 kV，錐孔電壓為25 V，離子源溫度250 ℃。

1.3.5NMR分析

將花色苷單體溶于氘代甲醇（CD3OD）中，V arian 500進行1H NMR分析，操作溫度為300 K。

1.3.6花色苷單體化合物的體外抗氧化活性測定

1.3.6.1DPPH自由基清除能力測定

參照Hu Bing［15］、Liu Ying［16］等報道的方法并略做改動，用無水乙醇配制0.4 mmol/L的DPPH溶液，取一定質量濃度梯度（0.01、0.02、0.05、0.10、0.15、0.20、0.35、0.50 mg/mL）的樣品25 μL與150 μL的DPPH溶液分別加入到96 孔板，30 ℃條件下暗反應30 min，通過酶標儀測定反應體系在517 nm波長處的吸光度。IC50用來表示清除率達到50%的樣品質量濃度。

式中：A0為以水代替樣品溶液實驗組的吸光度；A2為以乙醇代替DPPH溶液實驗組的吸光度；A1為樣品與DPPH反應后的吸光度。

1.3.6.2超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力測定

采用Beauchamp等［17］方法，略做改動，0.1 mol/L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）配制156 μmol/L NBT溶液、468 μmol/L NADH溶液、60 μmol/L吩嗪硫酸甲酯溶液（phenazine methosulphate，PMS）。取50 μL一定質量濃度梯度（0.02、0.05、0.10、0.15、0.20、0.35、0.50 mg/mL）樣品+50 μL NBT+50 μL NADH+ 50 μL PMS于96 孔板，混勻反應體系，25 ℃水浴5 min，通過酶標儀測定560 nm波長處測吸光度。

式中：A0為以水代替樣品實驗組的吸光度；A2為以磷酸鹽緩沖液代替NBT溶液實驗組的吸光度；A1為樣品參與的吸光度。

1.4統計分析

采用Origin 8.0、SPSS 19.0、MestReNova軟件，利用方差分析（analysis of variance，ANOVA）進行實驗數據處理及分析，P＜0.01為差異極顯著。

2　結果與分析

2.1黑果枸杞花色苷單體的分離純化

黑果枸杞通過浸提、過濾、濃縮、AB-8大孔樹脂處理，得到花色苷粗提物。粗提物按照1.3.3節方法進行HPLC分析，結果如圖1。黑果枸杞中含有一種含量較高、在280 nm和530 nm波長處有較高吸收峰的花色苷物質（P1）。

通過?KTA蛋白純化系統和YMC-PACK ODS-A色譜柱（20 mm×250 mm，5 μm）對花色苷粗提物進行分離純化（圖2），將不同出峰時間的收集物按1.3.2節方法進行HPLC分析發現第9、10兩管收集的組分純度很高（97%以上），在相同的HPLC條件下的出峰時間（圖3）與粗提物中含量最高的花色苷類物質P 1（圖1）相同，可以確定通過?KTA系統成功將黑果枸杞中的花色苷類物質P1分離純化，得到純度較高的該花色苷單體。

圖1　黑果枸杞粗提物的HPLCC色譜Fig. 1 HPLC chromatogram of the crude extract from Lycium ruthenicum Murray fruit

圖2　黑果枸杞粗提物經?KTA蛋白純化系統分離純化的色譜圖Fig. 2 Chromatogram of the crude extract from Lycium ruthenicum Murray fruits by ?KTA protein purification system

圖3　P1的HPLC色譜圖Fig. 3 HPLC chromatogram of P1

2.2花色苷類物質P1的結 構解析

將樣品P1溶解過膜進行HPLC-DAD/MS分析，得到化合物P1的一級質譜（圖4）和二級質譜圖（圖5）。通過圖4可得化合物P1（［M+H］+）m/z 933.4，從圖5可看出其共有3 個分子片段， m/z 771.3 （M-162）表明P1失去一分子葡萄糖（m/z 162）；m/z 479.1（M-308-146）表明P1失去了一分子的香豆酸（m/z 146）和一分子的蕓香糖（m/z 308）；m/z 317.1（M-308-146-162）表明P1擁有一個矮牽牛素配基（m/z 317）［18-20］，目前為止對黑果枸杞的研究表明黑果枸杞中的花色苷主要是矮牽牛素花色苷、飛燕草素花色苷和錦葵素花色苷［12］，且矮牽牛素花色苷的含量遠多于其他種類的花色苷［1］。綜上可認定花色苷類物質P1為矮牽牛素花色苷的衍生物，通過計算可得其分子式為C43H49O23。

圖4　P1的一級質譜圖Fig. 4 Mass spectrum of P1

圖5　P1的二級質譜圖Fig. 5 MS/MS spectrum of P1

通過MestReNova分析化合物P1核磁數據［1H NMR（500 MHz， CD3OD）: δ 8.95 （s， 1H）， 8.08 （d， J = 5.2 Hz， 1H），7.99 （s， 1H）， 7.82 （s， 1H）， 7.63 （d， J = 6.3 Hz， 1H）， 7.61～7.58（m， 1H）， 7.55 （s， 1H）， 7.48～7.45 （m， 1H）， 7.42 （d， J = 8.6 Hz，1H）， 7.04 （d， J = 19.3 Hz， 1H）， 6.81 （dd， J = 8.7， 2.4 Hz， 1H），6.76 （d， J = 1.9 Hz， 1H）， 6.74 （dd， J = 3.7， 2.0 Hz， 1H）， 6.71 （d，J = 2.0 Hz， 1H）， 6.66 （t， J = 2.8 Hz， 1H）， 6.64 （d， J = 2.0 Hz，1H）， 6.36 （s， 1H）， 6.33 （s， 1H）， 6.29 （dd， J = 6.6， 2.1 Hz， 1H），6.26 （s， 1H）， 6.23 （s， 1H）， 6.10 （d， J = 2.0 Hz， 1H）， 6.07 （d， J = 2.0 Hz， 1H）， 5.50 （d， J = 6.8 Hz， 1H）， 5.19 （d， J = 7.1 Hz，1H） ， 4.98 （d， J = 3.1 Hz， 1H）， 4.96 （s， 1H）， 4.93 （s， 1H）， 4.90（d， J = 4.1 Hz， 1H）， 4.82 （s， 29H）， 4.71 （s， 1H）， 4.04 （s， 1H），4.02 （s， 1H）， 4.00 （d， J = 4.7 Hz， 1H）， 3.95 （s， 1H）， 3.91～3.86（m， 1H）， 3.82 （d， J = 2.8 Hz， 1H）， 3.73 （s， 1H）， 3.56 （s， 1H），3.51 （s， 1H）， 3.49 （s， 1H）， 3.47 （d， J = 3.6 Hz， 1H）， 3.45 （s，1H）， 3.43 （s， 1H）， 3.41 （s， 1H）， 3.38 （s， 1H）， 3.29 （s， 1H）， 3.28（s， 1H）， 3.26 （s， 1H）， 3.24 （s， 1H）， 1.99 （s， 1H）， 1.94 （s， 1H），1.13～1.10 （m， 1H）， 1.00 （d， J = 6.3 Hz， 1H）］和根據有關報道花青素順反結構的異同主要體現在1H NMR譜耦合常數的差異，參考相關文獻［1，11，21-25］鑒定P1為矮牽牛素3-O-蕓香糖（反式-香豆?；?5-O-葡萄糖苷，其結構如圖6所示。

圖6　矮牽牛素33--O-蕓香糖（反式-香豆酰基）--55--O-葡萄糖苷的結構圖Fig. 6 Struc ture of petunidin 3-O-［rhamnopyranosyl-（trans-pcoumaroyl）］-5-O-［β-D-glucopyranoside］

2.3花色苷類物質P1的體外抗氧化活性

圖7　P1、黑果枸杞粗提物、VC對DPPH自由基的清除能力Fig. 7 Scavenging activities of P1， crude extract and VC on DPPH free radicals

以抗壞血酸（VC）為陽性對照，對比花色苷類物質P1與黑果枸杞粗提物的體外抗氧化能力，從圖7可以看出，在0～300 μg/mL質量濃度范圍內花色苷P1對DPPH自由基的清除能力極顯著強于VC和黑果枸杞粗提物（P＜0.01），其IC50為32.5 μg/mL；在300～500 μg/mL質量濃度范圍內P1對DPPH自由基的清除能力相對于VC無顯著性差異，但P1對DPPH自由基的清除能力仍極顯著高于黑果枸杞粗提物（P＜0.01）。從圖8可以看出，P1相對于黑果枸杞粗提物、VC之間對的清除率均有極顯著性差異（P＜0.01），P1對的清除作用明顯強于黑果枸杞粗提物和VC，其IC50為106.5 μg/mL。因此，經分離純化后的花色苷單體化合物P1具有顯著的清除DPPH自由基和的能力。

圖8　P1、黑果枸杞粗提物、·的清除能力Fig. 8 Scavenging activities of P1， crude extract and VC on superoxide anion free radicals

3　結 論

利用AB-8大孔樹脂柱層析、?KTA Purifier蛋白純化系統、YMC-PACK ODS-A色譜柱從黑果枸杞中分離純化了一種高含量的花色苷類物質P1，經HPLC-MS和NMR分析P1為矮牽牛素3-O-蕓香糖（反式-香豆?；?5-O-葡萄糖苷，體外抗氧化實驗表明該花色苷具有顯著的DPPH自由基和清除能力。

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Purification and Antioxidant Activity of an Anthocyanin from Lycium ruthenicum Murray

TANG Jilong1， YAN Yamei1，2，*， CAO Youlong2，*， ZENG Xiaoxiong1， SUN Yi1， HU Bing1， ZHOU Li1
（1. College of Food Science and Technology， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China；2. National Wolfberry Engineering Research Center， Yinchuan 750004， China）

An anthocyanin compound with over 97% purity was purifi ed from fruits of Lycium ruthenicum Murray with an ?KTA protein purifi cation system （equipped with a YMC-PACK ODS-A column with methanol: acetonitrile: formic acid in water （4:19:1， V/V） as mobile phase at a fl ow rate of 2 mL/min）. The purifi ed anthocyanin was identifi ed as petunidin 3-O-［rhamnopyranosyl-（trans-p-coumaroyl）］-5-O-［β-D-glucopyranoside］ by mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectrometry. Furthermore， the anthocyanin showed potent scavenging activities on 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH） and superoxide anion free radicals in antioxidant assays in vitro.

Lycium ruthenicum Murray； anthocyanin； purifi cati on； structural identifi cation； antioxidant activity

10.7506/spkx1002-6630-201615019

Q946.83；TS201.2

A

1002-6630（2016）15-0113-05

2015-09-30

寧夏自然科學基金項目（NZ15124）；寧夏農林科學院對外合作項目（JLC201601）；寧夏農林科學院先導項目（NKYJ-15-16；NKYZ-16-0505）；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目

唐驥龍（1990—），男，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：2013108022@njau.edu.cn

閆亞美（1982—），女，副研究員，博士，研究方向為枸杞加工與貯藏。E-mail：yanyamei@163.com

曹有龍（1963—），男，研究員，博士，研究方向為枸杞植物學。E-mail：youlongck@163.com

引文格式：