食源亞歷山大藻核糖體DNA分子特征及其產毒特性的遺傳差異

谷立慧，方 祥，鐘青萍，廖振林，王 麗*

（華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642）

食源亞歷山大藻核糖體DNA分子特征及其產毒特性的遺傳差異

谷立慧，方 祥，鐘青萍，廖振林，王 麗*

（華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642）

亞歷山大藻可代謝產生麻痹性貝毒素，對人類健康和食品安全造成嚴重威脅。以核糖體DNA為研究對象，利用生物信息學及計算機分析軟件對食源亞歷山大藻核糖體DNA的分子特征進行分析，并且對亞歷山大藻的產毒特性進行遺傳差異研究。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增亞歷山大藻核糖體18S rDNA-28S rDNA區域，利用DNAdist計算5.8S rDNA-ITS區域序列間距離值序數，同時，利用PCR-限制性片段長度多態性（restricted fragment length polymorphisms，RFLP）技術，對核糖體18S rDNA-28S rDNA進行測序分析，選擇限制性內切酶MboⅡ繪制內切酶圖譜。結果表明：亞歷山大藻無毒株L35與產毒株在5.8S rDNA-ITS區域序列間核苷酸的差異值可達到0.201～0.488，與同屬無毒亞歷山大藻的核苷酸差異值＜0.004；通過酶切圖譜特征條帶可以準確地將不同亞歷山大藻種產毒類型分3 類，酶切圖譜相似的藻種產生的毒素組分相同。因此，食源亞歷山大藻產毒與否以及產毒類型體現為核糖體DNA遺傳信息中存在顯著差異。

亞歷山大藻；核酸序列；毒素；分子生物學

谷立慧， 方祥， 鐘青萍， 等. 食源亞歷山大藻核糖體DNA分子特征及其產毒特性的遺傳差異［J］. 食品科學， 2016， 37（15）: 198-203. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615033. http://www.spkx.net.cn

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當前，麻痹性貝毒素（paralytic shellfish poisoning，PSP）與人類健康和食品安全的關系受到越來越多的關注［1］。亞歷山大藻（Alexandrium）是一類在全世界海區都廣泛分布的甲藻［2-3］，其中大部分種類都可以產生麻痹性貝毒素。在過去幾十年中，亞歷山大藻的爆發頻率呈顯著增加趨勢，對海洋漁業、人類健康以及海洋食品的開發都造成嚴重危害，引起人們的日益重視［4］。其中一個引起共同關注的理論問題是，亞歷山大藻形態特征容易隨環境變化而變化［5］，它們保守的形態學特征掩飾了其遺傳上的多樣性。因此，有必要在分子水平研究產毒藻種之間的遺傳差異。核糖體DNA（ribosomal DNA，rDNA）普遍存在于所有的生物細胞中，并且具有相似的結構和功能，是目前可用于生物比較分析的指標［6］，并且rDNA基因已被證實是在不同系統水平上進行系統和進化分析的良好指標［7-8］。綜合眾多的研究成果可知，在研究生物不同類群時，可采用rDNA序列中不同區域作為指標，核糖體小亞基rDNA基因、5.8S rDNA基因進化速率慢，常用于研究科級及以上遺傳關系；28S rDNA的高變區和內源轉錄間隔區（internally transcribed spacer，ITS）進化速率比編碼區快，一般用于屬、種間甚至種群間的遺傳關系。而包括5.8S rDNA在內的ITS區域既有保守區又有高變區，且長度適宜，成為目前對亞歷山大藻進行遺傳及分子特征差異分析的最為理想的研究區域。

不同有毒亞歷山大藻產生的毒素種類不同。學者們對亞歷山大藻毒素組成進行了大量研究［9-10］，發現不同藻種之間的毒素組成是不同的，不同株系的毒素組成也不一樣。目前不同藻種之間藻毒素組成差異分析多采用高效液相色譜系統［11］、反相色譜柱、二維蛋白電泳等［12］，還未發現在分子水平上研究鑒別亞歷山大藻種之間產毒種類差別的報道。本實驗將根據亞歷山大藻核糖體5.8S rDNA-ITS區域序列信息，結合生物信息學知識和計算機分析軟件，用分子生物學方法分析亞歷山大藻的分子特征并討論藻種在是否產毒的問題上的遺傳差異。根據核糖體18S rDNA-28S rDNA序列信息，用限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應（polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）方法探討亞歷山大藻種的產毒種類與自身核糖體DNA的關系。研究結果將對亞歷山大藻產毒特性的遺傳信息研究提供一定的理論基礎，同時對于保證海洋食品的安全開發和及時有效地監測貝類的生物污染提供有效的技術手段。

1　材料與方法

1.1材料

實驗所用藻種由暨南大學水生生物研究所和廈門大學近海海洋環境科學國家重點實驗室提供，分離自近海魚、貝類水產品，藻種信息見表1。

表1　藻種信息Table 1 Information about algae tested in this study

藻種已通過光學顯微鏡及掃描電子顯微鏡形態觀察，結合rDNA序列比較等方法鑒定其中6 株為產PSP藻種，而另一株塔瑪亞歷山大藻（Alexandrium tamarense）L35鑒定為無毒藻株。單藻種培養在含500 mL f/2培養液的1 000 mL錐形瓶中，接種密度約為160 個/mL，培養溫度（20±1）℃，光照度為8 000 lx，由白色熒光燈供光，光/暗=12 h/12 h。每天定時晃動錐形瓶2 次，每周更換培養基1 次。每天早上09：00取藻液滴于浮游生物計數框上，在光學顯微鏡下鏡檢計數。

1.2方法

1.2.1藻基因組DNA的提取

藻種接種培養后，在每天早上09：00取樣，鏡檢計數，作細胞生長曲線。根據亞歷山大藻的生長曲線，設定在第7、12、19天用低溫高速離心方法收集細胞。4 ℃、8 000 r/min離心收集100 mL穩定生長期亞歷山大藻細胞，-80 ℃冷凍10 min，然后立即置于65 ℃溫育10 min，反復凍融3 次。加入10%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）和蛋白酶K，37 ℃保溫1 h，再用質量分數0.4%的β-巰基乙醇、0.8%的聚乙烯吡咯烷酮在65 ℃條件下保溫1 h去除多酚，接著用溴化十六烷基三甲銨（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）-NaCl溶液將可溶性多糖成分分離，氯仿-異戊醇抽提蛋白質，最后用冰的無水乙醇洗滌沉淀DNA并除鹽。提取后的DNA用紫外分光光度法測量濃度、純度，并結合電泳分析觀察基因組質量。

1.2.2PCR擴增核糖體18S rDNA-28S rDNA區域及產物純化、測序

1.2.2.1引物設計

根據核糖體DNA的結構組成，分別在18S rDNA小亞基位置和28S rDNA大亞基位置設計一對引物，向5.8S方向擴增。引物a利用的是甲藻18S rDNA專一引物（5’-TGTCTCAAAGATTAAGCCATG-3’），引物b利用的是亞歷山大藻屬28S rDNA區域特異性引物（5’- CCTTGGTCCGTGTTTCAAGA-3’）［13-14］。

1.2.2.2PCR擴增及反應程序

50 μL PCR反應液組成：1 μL模板、30 pmol各引物、1.25 U Taq DNA聚合酶、2 μL脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（10 mmol/L）、5 μL l×ThermoPol Buffer。擴增循環條件為：94 ℃預變性5 min，之后94 ℃變性30 s；52 ℃退火1 min；72 ℃延伸2 min，共30 個循環，最后延伸7 min，擴增產物置于-20 ℃保存。取2 μL產物在1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，溴化乙錠（ethidium bromide，EB）染色。電泳條件：100 V，30 min［15］。

1.2.2.3PCR產物純化、測序

PCR擴增產物用DNA凝膠純化試劑盒進行純化，純化后的DNA片段送上海英駿生物有限公司測序。

1.2.3序列分析

在美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）服務器上（http://www. ncbi.nih.gov）用BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）進行同源檢測，證實所得序列為ITS1、ITS2、5.8S rDNA以及部分18S rDNA、28SrDNA區域。實驗測得的序列和甲藻ITS序列（來自GenBank）用計算機軟件進行序列對齊排序和比較、序列間距離值序數（Knuc值）計算。以計算機分析軟件包Phylip version 3.5中的DNAdist進行計算。

1.2.4PCR-RFLP分析產毒株毒素組成與核糖體DNA的關系

PCR-RFLP分析方法是在RFLP分析方法的基礎上發展建立的一種更為簡便的DNA分型技術。該方法基本原理是利用PCR擴增出目的DNA，擴增產物再用特異性內切酶消化切割成不同大小和不同數量的片段，通過凝膠電泳分離，電泳圖譜呈現多態性條型。將6 種產毒亞歷山大藻核糖體18S rDNA-28S rDNA區域測序，所得序列用CLUSTALW軟件進行多重比對，尋找保守序列。用Bioedit軟件分析序列并找到能同時有5 個以上酶切位點的限制性內切酶，按照內切酶種類常見、價格低廉，酶切條帶電泳位置差異明顯的原則選擇內切酶（具體軟件操作：打開Bioedit軟件系統，輸入6 條序列，在sequence命令下打開Nucleic Acid項目，選擇Restriction Map運行）。選定限制性內切酶后，進行內切酶消化反應：20 μL內切酶消化體系包括10×酶切反應緩沖液2 μL、PCR產物8 μL、限制性內切酶1 μL，無菌雙蒸水補足至20 μL。在37 ℃條件下放置反應1 h后，加入2μL 10×Loading Buffer終止反應。酶切后的產物進行瓊脂糖凝聚電泳分析：電壓100 V，電泳25 min左右。

2　結果與分析

2.1亞歷山大藻核糖體18S rDNA-28S rDNA區域PCR擴增結果

7 株亞歷山大藻核糖體片段18S rDNA-28S rDNA區域經PCR擴增反應成功獲得，電泳結果見圖1。

圖1　7 株亞歷山大藻核糖體DNA18S rDNA-28S rDNA片段的PCRR擴增結果Fig. 1 PCR results of the fragments of 18S-28S ribosomal DNA region in seven Alexandrium strains

由圖1可知，使用PCR技術可以成功地擴增出7 株亞歷山大藻對應的DNA片段，測序結果經在NCBI上進行BLAST分析證實為亞歷山大藻的rDNA片段。

2.2亞歷山大藻5.8S rDNA-ITS區序列分子特征分析結果

將7 株亞歷山大藻的核糖體測序結果去掉18S rDNA和28S rDNA序列，得到這7 株亞歷山大藻的5.8S rDNA-ITS區序列長度分別是：微小亞歷山大藻A. minutum AMTW02，516 bp；鏈狀亞歷山大藻A. catenella ACDH03，515 bp；塔瑪亞歷山大藻A. tamarense ATMJ01，513 bp；鏈狀亞歷山大藻A. catenella L65，515 bp；塔瑪亞歷山大藻A. tamarense L66，516 bp；愛德森亞歷山大藻A. andersoni CCMP2222，514 bp；塔瑪亞歷山大藻A. tamarense L35，513 bp。

再將亞歷山大藻的5.8S rDNA-ITS區域與從GenBank獲得的系統發育關系較近的甲藻序列進行比較。采用計算機分析軟件包PCgene 6.0對所獲得的亞歷山大藻屬7 種12 個株系的rDNA-ITS區全序列進行排列和比較。以計算機分析軟件Phylip version 3.5的DNAdist計算Knuc值（根據Kimura的two-parameter model）得出：1）同種有毒藻種A. tamarense或A. catenella，個體之間根據核苷酸差異計算得出Knuc值很小（＜0.01），但是種與種之間ITS區核苷酸差異較大，Knuc值＞0.2；2）初步鑒定為無毒的A. tamarense L35，其分子水平上表現出與有毒株系較大的差異，與有毒A. tamarense ATMJ01的核苷酸差異值達到0.221，與有毒A. catenella L65差異值達到0.365；而與無毒的A. tamarense WKS-1和A. tamarense CU-15的核苷酸差異較小，分別為0.003和0.004；3）A. pseudogonyaulax和A. insuetum為比較類群種變異相對較大的2 個種，與各個種的差異值分別為0.478～0.526和0.435～0.511。各序列之間序列比較結果見表2。

表2　亞歷山大藻屬不同種及不同株系rDNA ITS區序列（Knnuucc）比較結果Table 2 Distance values （Knuc） between rDNA ITS sequences of 12 representative species or strains of Aeardrium

亞歷山大藻其屬下不僅包含一半以上的有毒藻種類，而且根據毒性大小差異，有的種類還可劃分為有毒株和無毒株［16］。那么，這些毒性不同但是形態上卻相似的株系，其基因水平上是否存在差異呢？本實驗所研究的對象無毒亞歷山大藻L35株系，形態上鑒定為A. tamarense，與有毒的A. tamarense形態特征基本相同。但是，無毒亞歷山大藻L35在5.8S rDNA-ITS區序列特征上卻表現出與有毒的A. tamarense較大的差異，序列間核苷酸的差異值可達到0.201～0.488，與無毒的A. tamarense的核苷酸差異值＜0.004。這些比較結果表明，Alexandrium有毒株和無毒株在核糖體DNA序列上存在顯著的遺傳差異。

2.3核糖體18S rDNA-28S rDNA區域PCR-RFLP結果分析

為研究產毒藻的核糖體分子特征差異，對6 株產毒亞歷山大藻核糖體DNA的擴增產物進行測序，得到6 株藻的18S rDNA-28S rDNA序列長度分別為：微小亞歷山大藻A. minutum AMTW02，2 967 bp；鏈狀亞歷山大藻A. catenella ACDH03，3 018 bp；塔瑪亞歷山大藻A. tamarense ATMJ01，3 008 bp；鏈狀亞歷山大藻A. catenella L65，3 015 bp；塔瑪亞歷山大藻A. tamarense L66，3 016 bp；愛德森亞歷山大藻A. andersoni CCMP2222，2 985 bp。

通過序列信息分析比較，選擇MboⅡ限制性內切酶用于本次PCR產物酶切實驗。由圖2A（模擬圖譜）可知，MboⅡ用于酶切核糖體擴增產物時，理論上可以切出3 種DNA條型，并且，酶切條帶電泳位置差異明顯。電泳實驗結果見圖2B，A. catenella ACDH03、A. tamarense ATMJ01、A. catenella L65和A. tamarense L66條型較為一致，并且與其他兩種藻的圖譜有明顯差異。這4 株藻有3 條共同的DNA片段，大小分別為1 000 bp左右、640 bp和295 bp左右，與預測結果基本一致。另外，A. minutum AMTW02和A. andersoni CCMP2222的酶切圖譜也基本與預測結果一致。A. minutum在865 bp左右有一條區別于A. tamarense、A. catenella的特征條帶；A. andersoni在800 bp左右有一條特征條帶，均與預計酶切片段大小相符。以上結果說明，本實驗選擇的限制性內切酶酶切位點合適，酶切片段大小分布合理。

圖2　產毒亞歷山大藻限制性酶切圖譜Fig. 2 Restriction endonuclease maps of toxic Alexandrium

亞歷山大藻產生的神經麻痹性貝毒素是由多種不同的組分組成的。根據PSP分子結構中R4基團的不同，毒素可分為4 類：1）氨基甲酸酯類毒素，包括石房蛤毒素（saxitoxin，STX）、新石房蛤毒素（neoSTX）、膝溝藻毒素（gonyautoxin，GTX）1～4；2）N-磺酰氨甲酰基類毒素（N-sulfocarbamoyl toxins），包括GTX5（B1）、GTX6（B2）、C1～4；3）脫氨甲酰基類毒素（decarbamoyl toxins），包括dcSTX、dcneoSTX、dcGTX1～4；4）脫氧脫氨甲酰基類毒素（deoxydecarbamoyl toxins），包括doSTX、doGTX2，3。研究資料表明，產毒亞歷山大藻藻種之間產生毒素的組成成分差別很大［9，17-18］。A. tamarense和A. catenella藻種產生毒素的成分主要以STX、C2、GTX毒素為主，3 種毒素含量占所含毒素總量的85%～90%以上。有研究表明［19］，A. tamarense ATHK中毒素的主要組分為GTX1、4、5、6及C毒素，其中毒素含量最高的為GTX。劉曉麗等［20］對中國東海一株A. catenella進行分析表明，該藻的毒素成分主要為GTX5、GTX4和C2，其中GTX5含量達到了52%。A. catenella ACDH主要含有C毒素，同時含有GTX1、3、4毒素［19］。A. minutum產生毒素成分主要有GTX-1、GTX-2、GTX-3，其含量占總量的75%～85%。A. minutum AM-1主要含有GTX1、2、3、4及少量的neoSTX毒素［19］。卞中園等［21］用高效液相色譜技術檢測到A. minutum AMTW株系含有的毒素為GTX1-4。而A. andersoni產生毒素的組分主要以C1和C2為主，含量占毒素總量的65%～85%。從圖2限制性內切酶圖譜可看出，酶切類型分3 類，酶切圖譜相似的藻種產生的毒素組分是相同的，利用PCR-RFLP方法，通過擴增產物的酶切圖譜特征條帶可以快速初篩亞歷山大藻所產的麻痹性貝毒素類型。

3　結 論

針對亞歷山大藻18S rDNA-28S rDNA核糖體DNA進行PCR擴增，對其中的5.8S rDNA-ITS區域序列信息利用計算機軟件和生物信息學手段進行比較分析。通過計算遺傳距離，發現無毒A. tamarense L35在系統發育關系上表現出與有毒亞歷山大藻存在較大的差異，序列間核苷酸的差異值可達到0.201～0.488，系統發育關系遠；與無毒亞歷山大藻的核苷酸差異值＜0.004，系統發育關系近。研究結果證明，亞歷山大藻有毒株與無毒株在核糖體DNA信息上存在顯著遺傳差異。在今后的實驗中，將增加標準菌株種類，更加深入地研究食源亞歷山大藻DNA分子特征及其產毒特性的遺傳差異。

有毒亞歷山大藻不同藻種之間產生的毒素組分是不同的，目前毒素組分的鑒定手段還比較繁冗。基于此問題，本實驗設計使用PCR-RFLP方法，針對亞歷山大藻18S rDNA-28S rDNA擴增產物進行測序，并選擇了合適的內切酶MboⅡ，通過酶切圖譜特征條帶可以準確地將不同亞歷山大藻種產毒類型分3 類，酶切圖譜相似的藻種產生的毒素組分是相同的，同時也證明產毒藻毒素的組成成分與rDNA遺傳信息密切相關。

開發海洋藻類作為普通食品或者功能性食品是食品工業研究的熱點［22-23］。但是，海洋中廣泛存在的產毒素藻類，如亞歷山大藻及其產生的麻痹性貝毒素對食品的深度加工安全造成嚴重威脅，是人類健康面臨的非常嚴峻的公共衛生問題［24］。目前對亞歷山大藻及其產生的麻痹性貝毒素的監測已有多種技術手段［25］，但是，對其個體產毒差異的分子基礎研究還比較薄弱。而深層次的遺傳特征分析、分子特征識別是精確、快速鑒定產毒素亞歷山大藻的基礎。因此，為有效防止麻痹性貝毒素對食品安全和公眾健康的影響，今后應該在對產毒亞歷山大藻進行深入的分子研究基礎上，建立完善的監測體系，預防麻痹性貝毒素進入食物鏈，杜絕重大食品中毒事件的發生。

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Molecular Characteristics of Ribosome DNA and Genetic Difference of Toxigenic Characteristics of Food-Borne Alexandrium Strains

GU Lihui， FANG Xiang， ZHONG Qingping， LIAO Zhenlin， WANG Li*
（College of Food Science， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China）

Paralytic shellfish poisoning could be caused by the toxin produced by Alexandrium strains， which seriously threatens human health and food safety. Molecular characteristics of ribosome DNA and toxic characteristics of foodborne Alexandrium species were analyzed by bioinformatics and computer analysis software. The 18S rDNA-28S rDNA region was amplified by PCR method， and 5.8S rDNA-ITS region was calculated by using DNAdist program. Moreover， th e 18S rDNA-28S rDNA region was sequenced by PCR restricted fragment length polymorphisms （RFLP） method， and Mbo II was selected for restriction endonuclease mapping. The results showed that nucleotide sequence differences in the 5.8S rDNA-ITS region between non-toxic strain Alexandrium L35 and toxic strains could reach 0.201-0.448， while values ＜ 0.004 were noted among non-toxin strains. T oxin could be distinguished into three types by the characteristic bands of endonuclease map， and toxin components were same if strains had similar endonuclease map. Hence toxin production ability and toxin types of Alexandrium strains reflected significant genetic differences in ribosome DNA.

Alexandrium； nucleic acid sequences； toxins； molecular biology

10.7506/spkx1002-6630-201615033

TS201.3

A

1002-6630（2016）15-0198-06

2015-11-17

廣東省科技計劃項目（2016A040403103）；2015年度國家星火計劃項目（2015GA780080）；國家自然科學基金青年科學基金項目（31301445）；華南農業大學精品資源共享課《食品微生物檢驗學》項目（bkjx2015058）

谷立慧（1994—），女，碩士研究生，研究方向為食品、健康與系統生物學。E-mail：632716259@qq.com

王麗（1980—），女，副教授，博士，研究方向為食品、健康與系統生物學。E-mail：wangli_scau@scau.edu.cn

引文格式：