毛酸漿發酵過程中的非酶褐變原因解析

朱 丹，李世燕，任躍英*，牛廣財，魏文毅，王 贏

（1.吉林農業大學中藥材學院，吉林 長春 130118；2.黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，黑龍江 大慶 163319；3.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319）

毛酸漿發酵過程中的非酶褐變原因解析

朱 丹1，2，李世燕3，任躍英1，*，牛廣財3，魏文毅3，王 贏3

（1.吉林農業大學中藥材學院，吉林 長春 130118；2.黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，黑龍江 大慶 163319；3.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319）

以毛酸漿為原料，同時接入酵母菌和乳酸菌，在25、30 ℃和37 ℃條件下對其進行發酵。以褐變度（browning degree，BD）為指標，檢測其在發酵過程中引起非酶褐變的抗壞血酸（VC）、5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethyl furfural，5-HMF）、多酚、還原糖、氨基酸態氮等化學組分的變化。采用通徑系數分析方法，解析毛酸漿發酵過程中非酶褐變的主要原因。結果表明，在25、30 ℃和37 ℃等不同發酵條件下，毛酸漿發酵液中5-HMF含量、還原糖含量、氨基酸態氮含量等變化與褐變度的變化密切相關。在25 ℃發酵條件下，5-HMF含量對褐變度起到的直接作用最強，5-HMF含量和還原糖含量的交互作用是決定褐變度的首要因素；在30 ℃發酵條件下，氨基酸態氮含量對褐變度起到的直接作用最強，5-HMF含量和氨基酸態氮含量的交互作用是決定褐變度的首要因素；在37 ℃發酵條件下，5-HMF含量對褐變度起到的直接作用最強，同時，也是決定褐變度的首要因素。美拉德反應（Maillard reaction）是毛酸漿發酵過程中非酶褐變的主要原因。

毛酸漿；發酵；非酶褐變；通徑分析

朱丹， 李世燕， 任躍英， 等. 毛酸漿發酵過程中的非酶褐變原因解析［J］. 食品科學， 2016， 37（15）: 204-208. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201615034. http://www.spkx.net.cn

ZHU Dan， LI Shiyan， REN Yueying， et al. Analysis of mechanism of non-enzymatic browning of Physalis pubescens L. during fermentation［J］. Food Science， 2016， 37（15）: 204-208. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615034. http://www.spkx.net.cn

毛酸漿（Physalis pubescens L.）別名洋菇娘、黃菇娘等，為茄科酸漿屬多年生草本植物［1］。毛酸漿是一種藥食兩用植物，具有解除疲勞、消除肌肉疼痛、降低血壓、預防動脈硬化和心血管疾病的發生和保護皮膚等作用［2-4］。利用微生物對其進行發酵，是毛酸漿的一種較常見的深加工方式。但是，在其發酵過程中，非酶褐變現象非常嚴重，產品顏色發生改變，降低了毛酸漿發酵產品的商品價值。目前普遍認為導致非酶褐變（non-enzymatic browning）的主要原因有：美拉德反應（Maillard reaction）、抗壞血酸（VC）氧化分解、多酚類物質氧化縮合反應以及焦糖化反應等［5-8］。由于焦糖化反應的發生條件約在150 ℃以上，而本研究中毛酸漿發酵的溫度較低（小于40 ℃），在此條件下發生焦糖化反應的概率非常小。因此，主要研究前3 種非酶褐變反應。

近年來，通徑分析在生物科學研究中的應用日益增多，可以用來闡述生物學科中諸多理論問題。通徑分析是建立在通徑系數概念基礎上的一種多元統計分析方法［9］。通徑系數能夠有效地表示相關變量間的原因對結果的直接影響效應，能夠估計出原因因素對效應因素的間接效應，從而比較各因素的相對重要性［10］。本研究通過檢測毛酸漿發酵過程中引起非酶褐變的VC、5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethyl furfural，5-HMF）、多酚、還原糖、氨基酸態氮等化學組分的含量變化，采用通徑分析得出各種發酵條件下引起非酶褐變的主要因素，以及各個因素之間的相互作用程度，以期為有效控制其褐變提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

毛酸漿，購于黑龍江省大慶市農貿市場。

安琪牌葡萄酒用高活性干酵母 安琪酵母股份有限公司；植物乳酸菌 中國科學院微生物研究所；白砂糖黑龍江北方糖業股份有限公司；沒食子酸、5-HMF（分析純） 美國Sigma公司；福林-酚試劑、3，5-二硝基水楊酸（分析純）、草酸（優級純）、硫代巴比妥酸 國藥集團化學試劑有限公司；無水碳酸鈉、抗壞血酸、三氯乙酸、氫氧化鈉、偏重亞硫酸鉀（分析純） 天津市大茂化學試劑廠；2，6-二氯酚靛酚（分析純） Alfa Aesar（中國）化學有限公司；Pectinex XXL果膠酶 諾維信（中國）生物技術有限公司。

1.2儀器與設備

HR7633型打漿機 珠海經濟特區飛利浦家庭電器有限公司；DRP-9052型電熱恒溫培養箱、SPH-250型生化培養箱 上海森信實驗儀器有限公司；UV-1100型紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器公司；Exploter分析天平 奧豪斯儀器上海有限公司；HWS24型恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；WS113手持糖度儀上海測維光電技術有限責任公司；BCN-1360型超凈工作臺 北京東聯哈爾儀器有限公司；PHS-3C型精密pH計 上海雷諾儀器廠；湘儀L420臺式低速自動平衡離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1毛酸漿發酵工藝流程與操作要點

毛酸漿→挑選→去萼片→清洗→破碎→酶解→調糖→加SO2→冷卻→接種→發酵→發酵液→測定↓

酵母菌、乳酸菌→活化→擴大培養

操作要點：選取成熟度好、粒大飽滿、無病蟲害、無霉變的毛酸漿鮮果，去除萼片，清水洗滌后熱燙30 s，瀝干后將其破碎，得到毛酸漿果汁原漿；按照1.6 mL/kg的比例加入Pectinex XXL果膠酶到毛酸漿原漿中，于50 ℃水浴酶解2 h［11-12］，用蔗糖調整糖度至22%，加入80 mg/kg的SO2后，攪動30 min。在無菌操作臺上按0.2%和1%同時接入已活化好的酵母菌和乳酸菌，分別置于25、30、37 ℃條件下進行發酵。每隔1 d取樣一次，在3 600 r/min離心15 min后，取上清液用于測定各項指標。

1.3.2指標測定方法

多酚含量：采用福林-酚法［13］；VC含量：采用2，6-二氯酚靛酚法［14］；還原糖含量：3，5-二硝基水楊酸法［15］；5-HMF含量：參考Cohen等［16］的測定方法；褐變度（browning degree，BD）：參考文獻［17］的方法；氨基酸態氮含量：參考GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》［18］進行測定。

1.3.3數據統計分析

以VC含量（X1）、5-HMF含量（X2）、多酚含量（X3）、還原糖含量（X4）、氨基酸態氮含量（X5）為自變量因子，以BD為應變量Y，對引起發酵液非酶褐變的各因子進行通徑分析。得到各因子間的相關系數，并求出直接通徑系數P1、P2、P3、P4、P5和各因子間的間接通徑系數Pij。直接通徑系數Pi反映各因素對毛酸漿發酵液BD的直接效應，間接通徑系數Pij用來表示某一因素對毛酸漿發酵液在發酵過程中BD的影響的間接效應。實驗數據參照文獻［19-20］進行處理，運用SPSS 20.0軟件，采用Duncan’s極差法對各項指標進行統計分析。

2　結果與分析

2.1毛酸漿發酵過程中的各指標檢測結果

表1　毛酸漿發酵過程中的各指標檢測結果Table 1 Physicochemical properties of Physalis pubescens L. during fermentation

2.225 ℃發酵條件下非酶褐變通徑分析

表2　各因子間相關系數Table 2 Correlation coefficients among chemical parameters of Physalis pubescens

在25 ℃發酵條件下，非酶褐變因子X1、X2、X3、X4、X5和褐變度Y之間的相關系數見表2，通徑分析見表3。25 ℃發酵條件下，被研究的5 個因子對BD的影響由大到小順序依次是：5-HMF含量（P2=0.841 0）、還原糖含量（P4= -0.787 0）、VC含量（P1=0.337 0）、氨基酸態氮含量（P5=-0.166 0）和多酚含量（P3=0.146 0）。從表3還可以看出，X2與其余4 個因素的交互作用十分明顯，而X3和X5與其他成分的交互作用很弱。

表3　通徑分析Table 3 Path analysis of chemical parameters of Physalis pubescens L. fermented at 25 ℃

決定系數表示各因素對結果的相對決定程度，由相關系數和通徑系數計算決定系數d。

根據（1）和（2）計算，得到的決定系數d如下：

由決定系數可知，5-HMF含量（X2）和還原糖含量（X4）的交互作用是影響25 ℃發酵條件下褐變度的第一決定因素，d24=1.318 4；5-HMF含量是影響褐變度的第二決定因素，d2=0.707 3；還原糖含量（X4）是影響褐變度的第三決定因素，d4=0.619 3；其余以此類推。∑d表示各Xi決定的褐變度增加量（Y）的變異平方和占褐變度的總變異平方和之比率。Pe為剩余通徑系數，表示未被考慮的一切可能影響Y的因素和試驗誤差［21］。本試驗中Pe較小，說明已考慮了影響毛酸漿發酵過程中非酶褐變的主要因素。

2.330 ℃發酵條件下非酶褐變通徑分析

在30 ℃發酵條件下，非酶褐變因子X1、X2、X3、X4、X5和褐變度Y之間的相關系數見表4，通徑分析見表5。對30 ℃發酵條件下的褐變度起首要作用的是氨基酸態氮含量（X5），其P5= 0.646 0；其次是5-HMF含量（X2）、VC含量（X1）、多酚含量（X3），而還原糖含量（X4）所起的作用最小。

表4　各因子間相關系數Table 4 Correlation coefficients among chemical parameters of Physalis pubescens

表5　通徑分析Table 5 Table of path analysis at 30℃

決定系數計算結果如下（方法同2.2節式（1）、（2））：

由決定系數可知，5-HMF含量（X2）和氨基酸態氮含量（X5）的交互作用是影響30 ℃條件下褐變度的第一決定因素，d25=0.593 8；氨基酸態氮含量（X5）是影響褐變度的第二決定因素，d5=0.417 3；5-HMF含量（X2）是影響褐變度的第三決定因素，d2= 0.212 6；其余以此類推。∑d=0.994 1，Pe= 0.076 6，說明已考慮了影響毛酸漿發酵過程中非酶褐變的主要因素。

2.437 ℃發酵條件下非酶褐變通徑分析

表6　各因子間相關系數Table 6 Correlation coefficients among chemical parameters of Physalis pubescens

在37 ℃發酵條件下，非酶褐變因子X1、X2、X3、X4、X5和褐變度Y之間的相關系數見表6，通徑分析見表7。對37 ℃發酵條件下的褐變度起首要作用的是5-HMF含量（X2），其P2= 0.887 0；其次是氨基酸態氮含量（P5=0.191 0）、還原糖含量（P4=0.041 0）、多酚含量（P3=0.033 0）、VC含量（P1= -0.004 0）。5-HMF含量（X2）與其他因子的交互作用也比較明顯。

表7　通徑分析Table 7 Path analysis of chemical parameters of Physalis pubescceennss LL.. fermented at 377 ℃

決定系數計算結果如下（方法同2.2節中式（1）、（2））：

由決定系數可知，5-HMF含量（X2）是影響37 ℃條件下褐變度的第一決定因素，d2=0.786 7；5-HMF含量（X2）和氨基酸態氮含量（X5）的交互作用是影響褐變度的第二決定因素，d25=0.314 4；5-HMF含量（X2）和還原糖含量（X4）的交互作用是影響褐變度的第三決定因素，d24=-0.069 8；其余以此類推。∑d=0.998 5，Pe= 0.038 7，說明已考慮了影響毛酸漿發酵過程中非酶褐變的主要因素。因此，在37 ℃發酵條件下，5-HMF含量（X2）對褐變度起到的直接作用最強，也是決定褐變度的首要因素。

3　討論與結論

非酶褐變通常是多種反應共同作用的結果，但在不同的產品中，有不同的主導反應類型。例如，香蕉汁在貯藏過程中則主要發生美拉德反應［22］；柑橘汁貯藏期間的非酶褐變主要是由VC降解引起［23］；而Damasceno等［24］指出在橙汁等抗壞血酸含量高的果汁中抗壞血酸降解才是引起褐變的主要因素。混濁蘋果汁在貯藏中發生的非酶褐變主要是由酚類的氧化聚合而引起［25］。美拉德反應是一種十分復雜的羰氨反應，即羰基化合物（還原糖類）與氨基化合物（氨基酸和蛋白質）經過一系列重排、脫水、縮合及聚合反應生成擬黑素的過程。主要有3 種反應途徑：在酸性條件下經1，2-烯醇化反應，形成呋喃（furural）及5-HMF；在堿性條件下經2，3-烯醇化反應形成還原酮及脫氧還原酮；在高溫條件下，經Amadori裂解最終生成類黑素［26］。VC是果汁中的一種主要營養成分，其氧化分解主要有兩種途徑：有氧分解反應最終生成還原酮；無氧分解的主要產物為糠醛［27］。近年來的研究表明，多酚的化學性質活潑，易氧化成苯醌，醌類物質能自發與親核物質結合（如酚類、巰基化合物及某些胺類），反應中生成的二聚體或多聚體可能通過結構重排，產生新的二酚二聚體，而新的二聚體更容易被氧化從而進入下一輪的循環，加快了酚的聚合，結果是形成褐色多聚體和更多的

本實驗在25、30 ℃和37 ℃發酵條件下，將毛酸漿的VC含量、5-HMF含量、多酚含量、還原糖含量、氨基酸態氮含量等成分與褐變度進行通徑系數分析，結果表明：1）在25 ℃發酵條件下，5-HMF含量對褐變度起到的直接作用最強，5-HMF含量和還 原糖含量的交互作用是決定褐變度的首要因素。2）在30 ℃發酵條件下，氨基酸態氮含量對褐變度起到的直接作用最強，5-HMF含量和氨基酸態氮含量的交互作用是決定褐變度的首要因素。3）在37 ℃發酵條件下，5-HMF含量對褐變度起到的直接作用最強，也是決定褐變度的首要因素。從整個發酵期看，在不同發酵溫度下，5-HMF都大量積累，氨基酸和還原糖參與整個發酵過程中，從而說明毛酸漿發酵過程中發生的非酶褐變主要由美拉德反應在酸性途徑下產生。綜上所述，美拉德反應是毛酸漿發酵過程中非酶褐變的主要原因。

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Analysis of Mechanism of Non-Enzymatic Browning of Physalis pubescens L. during Fermentation

ZHU Dan1，2， LI Shiyan3， REN Yueying1，*， NIU Guangcai3， WEI Wenyi3， WANG Ying3
（1. College of Chinese Medicinal Materials， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China；2. College of Life Science and Technology， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， China；3. College of Food Science， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， China）

The mixed culture fermentation of the fruit juice of Physalis pubescens L. with yeast and lactic acid bacteria was carried out at 25， 30 and 37 ℃， respectively. Changes in the contents of vitamin C， total phenols， 5-hydroxymethyl furfural （5-HMF）， reducing sugar and amino acid nitrogen， associated with non-enzymatic browning occurring during the fermentation process， were examined in order to explore the mechanism of non-enzymatic browning through path coefficient analysis. The results indicated that the change of browning degree （BD） was closely related to 5-HMF， reducing sugar，and amino acid nitrogen in the fruit juice of Physalis pubescens L. fermented at three temperatures. In addition， 5-HMF had the strongest direct impact on BD， while interaction between 5-HMF and reducing sugar was the chief determinant of non-enzymatic browning during fermentation at 25 ℃. When fermentation was done at 30 ℃， amino acid nitrogen had the strongest direct impact on BD and the major cause of non-enzymatic browning was interaction between 5-HMF and amino acid nitrogen. During fermentation at 37 ℃， the non-enzymatic browning of Physalis pubescens L. was mainly caused by 5-HMF as the principal determinant of BD. Therefore， Maillard reaction is the major cause of the non-enzymatic browning of Physalis pubescens L. during the fermentation process.

Physalis pubescens L.； fermentation； non-enzymatic browning； path coefficient analysis

10.7506/spkx1002-6630-201615034

TS255.3

A

1002-6630（2016）15-0204-05

2016-01-19

朱丹（1972—），女，副教授，博士研究生，研究方向為藥用植物。E-mail：623016878@qq.com

任躍英（1958—），女，教授，博士，研究方向為藥用植物。E-mail：381717169@qq.com

引文格式：