大豆品種和混菌發酵對納豆品質及風味改良效果研究

金 虎，時 杰，關 品，李坤朋，黃鳳洪，鈕琰星，王改改，陳 洪，周新安

（1.中國農業科學院油料作物研究所，湖北武漢 430062；2.湖北嘗香思食品有限公司，湖北潛江 433121）

大豆品種和混菌發酵對納豆品質及風味改良效果研究

金 虎1，時 杰1，關 品2，李坤朋1，*黃鳳洪1，鈕琰星1，王改改1，陳 洪1，周新安1

（1.中國農業科學院油料作物研究所，湖北武漢 430062；2.湖北嘗香思食品有限公司，湖北潛江 433121）

以納豆激酶活性和游離氨基酸含量為納豆營養品質評價指標，研究了不同品種大豆對發酵納豆營養品質的影響，并考察了乳酸菌和納豆芽孢桿菌混合發酵模式對改善納豆風味的作用效果。結果表明，不同大豆品種中蛋白含量差異對納豆品質影響不大，對同一品種大豆而言，種植地域差異對納豆激酶活性有影響，但對游離氨基酸含量影響不大；乳酸菌和納豆芽孢桿菌混合菌種發酵能夠明顯改善納豆風味，但同時也會降低納豆中游離氨基酸含量，適宜的乳酸菌和納豆芽孢桿菌接種體積比范圍（1.2∶1～2.0∶1）對納豆激酶分泌具有促進作用，適合納豆激酶表達的最佳接種體積比為1.6∶1。

納豆；納豆激酶；乳酸菌；風味；混菌發酵

0 引言

納豆是日本傳統的發酵食品，歷史悠久，其以大豆為原料，經納豆芽孢桿菌發酵而成。在納豆發酵過程中，納豆芽孢桿菌會產生一種絲氨酸蛋白酶（即納豆激酶），該酶具有纖溶活性，可以治療和預防血栓疾病。另外，納豆還具有抗腫瘤、降血壓、抗菌、抗氧化、預防骨質疏松、提高蛋白質的消化率等多種保健功能。納豆作為一種具有多種保健功能的大豆發酵食品，值得在我國推廣，但傳統的日本納豆帶有氨臭味，其風味使我國消費者難以接受。

為改善納豆的風味，許多研究者從工藝優化［1］、輔料添加［2］、混合發酵［3］和菌株改造［4］等方面做了大量的研究工作。該研究以湖北省幾個具有代表性的大豆品種為研究對象，對比考察以這幾種大豆以及市購東北大豆為原料對發酵納豆品質的影響。同時，考察了乳酸菌和納豆芽孢桿菌混合菌種發酵對納豆品質及風味改良的作用效果，為篩選適合納豆發酵的優異大豆品種及實現納豆產品的本土化和工業化提供參考。

1 材料與方法

1.1.1 試驗原料

鄂豆8號、早熟8號、鄂豆10號、中豆32、中豆30、天隆1號和天隆2號大豆，由中國農業科學院油料作物研究所周新安研究員提供；東北大豆，于附近市場購買。

1.1.2 菌種

納豆芽孢桿菌，購自中國工業微生物菌種保藏中心；乳酸菌為本實驗室保藏。

1.1.3 培養基

（1）乳酸菌種子培養基。蛋白胨10.0 g，牛肉膏5.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20 g，吐溫80 1.0 mL，K2HPO4·7H2O 2.0 g，三水醋酸鈉5.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·7H2O 0.05 g，將上述成分加入到1 000 mL蒸餾水中，pH值調節至6.5。

（2）納豆芽孢桿菌種子培養基。蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 5 g/L，pH值7.2。

1.2.1 菌種活化和搖瓶種子培養

先將保藏于-80℃冰箱中的納豆芽孢桿菌和乳酸菌分別轉接于LB和MRS斜面培養基上，然后分別放入28℃和37℃恒溫培養基中培養24 h，得到活化的菌株。分批挑取活化后的納豆芽孢桿菌和乳酸菌單菌，落于納豆芽孢桿菌和乳酸菌種子培養基中進行搖瓶培養，納豆芽孢桿菌培養溫度37℃，攪拌轉速200 r/min，培養時間14 h；乳酸菌培養為靜置培養，培養溫度37℃，培養時間24 h。

1.2.2 納豆發酵

將一定量不同品種大豆用清水沖洗除雜后，置于3倍量的清水中浸泡14～18 h。將浸泡好的大豆瀝水后，于121℃條件下滅菌30 min。待滅菌后的大豆冷卻至40℃左右時，將乳酸菌和納豆芽孢桿菌以不同體積比接種液態種子，攪拌均勻后放入37℃恒溫培養箱中培養24 h，將發酵好的納豆放入4℃冰箱后熟24 h，即得成熟的納豆。

1.2.3 納豆激酶活性檢測

采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法，具體方法見參考文獻［3］。取5 g納豆，加5 mL生理鹽水攪拌，在低溫（4℃）條件下提取1 h，吸取0.5 mL提取液于離心試管中，以轉速1 000 r/min于低溫（4℃）下離心10 min，取上清液待用。制瓊脂糖-纖維蛋白平板時，取1%瓊脂糖溶液16.2 mL，在45℃水浴中保溫30 min，然后將1.3 mL凝血酶溶液倒入瓊脂糖中，混勻后置于45℃水浴中保溫5 min的纖維蛋白原溶液16.2 mL，充分混合后立刻倒入培養皿中，室溫放置1 h，即得瓊脂糖-纖維平板。然后在平板上打直徑2 mm的孔，每孔點離心上清液樣品10 μL，靜置10 min，于37℃恒溫條件下培養18 h，測量溶圈大小。以尿激酶為標準曲線，計算納豆激酶活性。

1.2.4 游離氨基酸含量測定

取一定量混勻的納豆樣品放入研缽中細細研碎成糊狀，從中取1 g粉碎的納豆于燒杯中，用去離子水充分溶解并定容至50 mL，過夜存放。然后，按參考文獻［5］方法測定游離氨基酸質量濃度。

1.2.5 拉絲長度的測定及感官評定

見［6］并作適當修改。將納豆均勻攪拌后用筷子挑起，以10 cm為1個單位，從中間挑起，垂直拉10 cm為2個單位，再從拉起的10 cm中挑起，依次重復進行，直至拉斷。記錄拉絲的數量。

2 結果與討論

在相同發酵條件下，比較研究了湖北地區種植的不同大豆品種和市售東北大豆作為原料對發酵納豆品質的影響。

不同大豆品種對發酵納豆中納豆激酶活性和游離氨基酸含量的影響見表1。

表1 不同大豆品種對發酵納豆中納豆激酶活性和游離氨基酸含量的影響

由表1可知，湖北省大豆中蛋白含量普遍高于市售東北大豆，其中鄂豆8號大豆中蛋白含量高達48.8%，比市售東北大豆蛋白含量（41.5%）高7.3%；天隆2號大豆中蛋白和脂肪含量與東北大豆接近。納豆激酶活性和游離氨基酸含量作為評價納豆營養價值的重要指標，發酵納豆中納豆激酶活性和游離氨基酸含量與大豆原料中蛋白含量無明顯相關性，中豆32號中蛋白含量較高（47.6%），但納豆激酶活性最低，每1 g納豆中納豆激酶活性僅為183 IU。綜合考慮納豆激酶活性和游離氨基酸含量2種指標，天隆1號大豆為最適合納豆發酵大豆原料，其納豆激酶活性和游離氨基酸含量分別高達579 IU/g和300.9 μmol/g。

對同一大豆品種（鄂豆8號）在湖北不同種植地的大豆原料進行了收集，比較了這些大豆作為原料生產發酵納豆的情況。

同一大豆品種（鄂豆8號）不同種植地對發酵納豆品質的影響見表2。

表2 同一大豆品種（鄂豆8號）不同種植地對發酵納豆品質的影響

由表2可知，大豆中蛋白和脂肪含量不僅與大豆品種有關，還與種植地域相關。種植在朱湖村的大豆蛋白含量要普遍高于種植在楊林村的同品種大豆，最高蛋白含量相差5.1%。種植于朱湖村的鄂豆8號大豆作為原料發酵的納豆中納豆激酶活性是種植于楊林村大豆所發酵納豆激酶活性的1.9～2.3倍，明顯高于種植于楊林村的大豆。種植地域差異對同一大豆品種發酵納豆中游離氨基酸含量影響不大，游離氨基酸含量約在300 μmol/g。

在以單一納豆芽孢桿菌對大豆進行發酵時，發酵后的納豆具有很明顯的氨味。為此，本研究考察混合菌種發酵，即同時接種乳酸菌和納豆芽孢桿菌對改善納豆風味的效果。

乳酸菌和納豆芽孢桿菌接種比例對納豆發酵品質的影響見表3。

表3 乳酸菌和納豆芽孢桿菌接種比例對納豆發酵品質的影響

由表3可知，與單一納豆芽孢桿菌發酵相比，隨著乳酸菌接種比例的逐步增加，發酵納豆的氨味逐漸減弱，當乳酸菌和納豆芽孢桿菌接種體積比大于1∶1時，發酵納豆的氨味消失，且納豆呈現出特殊的醇香味，表明乳酸菌和納豆芽孢桿菌混菌發酵可以明顯改善納豆的風味。而且，混合菌種發酵對發酵納豆的形狀和金屬光澤沒有影響，對納豆拉絲效果也影響不大。

乳酸菌在改善納豆風味的同時，是否會對納豆營養品質尤其是納豆激酶活性產生影響。為此，考察了乳酸菌和納豆芽孢桿菌混合菌種發酵及接種比例對納豆激酶活性的影響。

乳酸菌與納豆芽孢桿菌接種比例對納豆激酶活性的影響見圖1。

由圖1可知，當乳酸菌和納豆芽孢桿菌接種比例逐漸增加至1時，納豆激酶活性略有降低（從670 IU/g降至460 IU/g）。當乳酸菌和納豆芽孢桿菌接種體積比從1∶1增加至1.6∶1時，納豆激酶活性顯著增加；當接種比例為1.6∶1時，納豆激酶活性高達1 080 IU/g，是單一納豆芽孢桿菌發酵時活性的1.6倍。但隨著接種比例的繼續增加，納豆激酶活性開始逐漸降低，當乳酸菌和納豆芽孢桿菌接種體積比為3∶1時，納豆激酶活性降至346 IU/g，約為單一納豆芽孢桿菌發酵時活性的0.5倍。上述結果表明，適宜的乳酸菌和納豆芽孢桿菌接種體積比范圍（1.2∶1～2.0∶1）對納豆激酶分泌具有促進作用，適合納豆激酶表達的最佳接種比例為1.6∶1。

圖1 乳酸菌與納豆芽孢桿菌接種比例對納豆激酶活性的影響

已有研究表明，納豆發酵過程中有50%～60%分解成水溶性氮化物，其中游離氨基酸含量占10%［7］。而且，納豆中游離氨基酸的含量與納豆風味直接相關，納豆中游離氨基酸態氮含量的高低可作為納豆生產工藝和產品品質的關鍵控制點［8］。

乳酸菌和納豆芽孢桿菌接種比例對納豆游離氨基酸含量的影響見圖2。

圖2 乳酸菌和納豆芽孢桿菌接種比例對納豆游離氨基酸含量的影響

由圖2可知，隨著乳酸菌接種比例的逐漸增加，納豆中游離氨基酸含量逐漸下降，當乳酸菌和納豆芽孢桿菌的接種體積比為1∶1時，游離氨基酸質量濃度約下降至單一納豆芽孢桿菌發酵時的50%，表明乳酸菌的添加弱化了大豆蛋白的分解速度。

3 結論

比較研究了湖北地區不同品種大豆和不同種植地同一品種大豆作為納豆發酵原料對納豆品質的影響。結果表明，天隆1號大豆為最適合納豆發酵大豆原料，其納豆激酶活性和游離氨基酸含量分別高達579 IU/g和300.9 μmol/g；種植在朱湖村的鄂豆8號大豆蛋白含量要普遍高于種植在楊林村的鄂豆8號大豆，最高蛋白含量相差5.1%；種植地域差異對同一大豆品種發酵納豆中游離氨基酸含量影響不大，游離氨基酸含量約在300 μmol/g；乳酸菌和納豆芽孢桿菌混合菌種發酵能夠明顯改善納豆風味，適宜的乳酸菌和納豆芽孢桿菌接種體積比范圍（1.2∶1～2.0∶1）對納豆激酶分泌具有促進作用，適合納豆激酶表達的最佳接種體積比為1.6∶1。

［1］ 關茵，肖然，李春.從工藝角度改善納豆風味的研究 ［J］.中國釀造，2010（6）：75-77.

［2］ 陳文珊，關茵，肖然，等.輔料對納豆風味影響的研究 ［J］.中國調味品，2011（1）：55-57.

［3］ 黃占旺，上官新晨，程軍輝，等.納豆混合發酵技術研究 ［J］.中國食品學報，2005（4）：70-73.

［4］ 黃蓓，吳旭蕾，錢炳俊，等.納豆芽孢桿菌rocG基因和ure基因敲除載體的構建 ［J］.上海交通大學學報（農業科學版），2013（5）：16-19.

［5］Lie S.The EBC-ninhydrin method for determination of free alpha amino nitrogen［J］.Journal of the Institute of Brewing，1973，79（1）：37-41.

［6］ 奚銳華，齊鳳蘭，陳有容.納豆生產工藝的優化 ［J］.食品工業科技，2004（3）：78-80.

［7］ 李麒.納豆的營養與保健價值 ［J］.中國食物與營養，2002（1）：48-49.

［8］ 王冬燕，王遠紅，郭麗萍，等.納豆中氨基酸態氮含量的測定 ［J］.食品工業科技，2010（9）：361-362.◇

The influences of soybean varieties on natto quality and mixed fermentation of Lactobacillus and Bacillus natto on natto flavor improvement are investigated based on the nutritional evaluation indexes of nattokinase activities and free amino acids content.The results indicate that natto quality is not influenced by the difference of protein contents in different soybean varieties.For the same soybean varieties，the difference of planting areas would influence the nattokinase activities but not the concentration of free amino acids.Mixed fermentation of Lactobacillus and Bacillus natto could improve the natto flavor significantly，but the concentration of free amino acids will be decreased correspondingly.A suitable ratio of Lactobacillus and Bacillus natto ranging from 1.2∶1～2.0∶1 can promote the secretion of nattokinase and the optimal ratio of Lactobacillus and Bacillus natto is 1.6∶1.

nattto；nattokinase；Lactobacillus；flavor；mixed fermentation

1671-9646（2016）09a-0004-04

TS214

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.09.002

2016-07-08

湖北省重大科技創新計劃項目（2014ABBOB）。

金 虎 （1980— ），男，博士，助理研究員，研究方向為油料餅粕的生物轉化與高值化利用。

黃鳳洪（1965— ），男，博士，研究員，研究方向為油料加工。