堿性蛋白酶的異源表達及其在制備CPP中的應用

凌 敏，董自星，李 玉，葉 松，王正祥，路福平

（1. 天津科技大學生物工程學院；2. 天津科技大學化工與材料學院，天津 300457）

堿性蛋白酶的異源表達及其在制備CPP中的應用

凌 敏1，董自星2，李 玉1，葉 松1，王正祥2，路福平1

（1. 天津科技大學生物工程學院；2. 天津科技大學化工與材料學院，天津 300457）

堿性蛋白酶是現代工業酶制劑中最重要的酶類之一，在人類日常生活中扮演著非常重要的角色.本研究以嗜堿芽胞桿菌（B. alcalophilus）TCCC11006基因組為模板，從中擴增出堿性蛋白酶基因apr，并構建重組表達質粒pHY-apr，將重組質粒電轉入蛋白酶基因缺失的地衣芽胞桿菌（B. licheniformis）H115中，實現了堿性蛋白酶的分泌表達.重組菌在LB培養基中最高酶活力達到3，199，U/mL，是出發菌株酶活力的1.82倍，發酵周期縮短了8，h.然后通過單因素和正交實驗對重組堿性蛋白酶水解酪蛋白的工藝參數進行優化，確定了最佳水解溫度、pH和酶添加量分別為50，℃、9.5和4，000，U/g.在最佳水解條件下，通過鋇-乙醇沉淀的方法制備生物活性肽——酪蛋白磷酸肽（CPP），其得率和氮磷物質的量比分別為14.8%和8.47.這為堿性蛋白酶在功能性食品制造方面的應用奠定了良好的基礎.

堿性蛋白酶；異源表達；水解；酪蛋白磷酸肽

堿性蛋白酶是指在pH偏堿性范圍內水解蛋白質肽鍵的一大類酶類，是目前工業中用量較多的酶之一［1］，其每年銷售額占全世界酶類銷售額的60%［2］.隨著人們對堿性蛋白酶應用研究的不斷深入，發現其在洗滌劑、食品加工、醫藥、環境保護、皮革制造、絲綢制造等行業都有十分重要的作用［3-9］.其中，地衣芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌是我國堿性蛋白酶的主要生產菌，但地衣芽胞桿菌具有比枯草芽胞桿菌更強的分泌表達系統，大約是枯草芽胞桿菌分泌能力的2倍，且地衣芽胞桿菌生長較慢，有利于剛分泌的蛋白充分折疊和運輸［10］.另外，利用微生物源堿性蛋白酶制備酪蛋白磷酸肽（CPP）已成為當前的研究熱點.被譽為“礦物質載體”的酪蛋白磷酸肽具有促進鈣、鐵、鋅、硒離子的吸收和利用的功能，也是目前促進鈣吸收較好的生物活性劑，被廣泛應用于食品、醫藥等領域［11］.現階段，CPP的生產通常采用價格較高的胰蛋白酶［12］，這在很大程度上限制了CPP的應用.因此，國內外許多專家學者都在尋找一種價格較為低廉的微生物源蛋白酶代替胰蛋白酶來制備CPP.而篩選高表達蛋白酶的新菌種、菌種誘變和構建高表達的重組菌是解決這個問題的主要方法.

目前，利用芽胞桿菌表達系統獲得重組蛋白酶來制備CPP的研究較少.本研究通過重組DNA的手段實現嗜堿芽胞桿菌來源的堿性蛋白酶在地衣芽胞桿菌中的分泌表達，提高其表達量并縮短了發酵周期.利用正交實驗優化重組堿性蛋白酶水解酪蛋白的工藝參數，提高產品中CPP的純度.旨在為堿性蛋白酶的大規模工業化生產及其替代胰蛋白酶制備CPP等方面奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

嗜堿芽胞桿菌（B.alcalophilus）TCCC11006、地衣芽胞桿菌（B.licheniformis）H115（蛋白酶基因缺失菌株）宿主菌和表達載體pHY等均由本研究室保藏.

1.1.2 培養基

嗜堿芽胞桿菌生長培養基（g/L）：牛肉膏 8，酵母浸粉 2，多聚蛋白胨 5，NaCl 2，瓊脂 17，酪蛋白 4，K2HPO418，pH自然.

嗜堿芽胞桿菌發酵培養基（g/L）：酵母浸粉 17，棉籽餅粉 30，麥芽糊精 100，檸檬酸鈉 3，氯化鈣2.6，K2HPO418，pH自然.

地衣芽胞桿菌H115生長和發酵培養基均為LB培養基（g/L）：蛋白胨 10，酵母提取物 5，NaCl 10.

干酪素篩選培養基（g/L）：干酪素 8，酵母抽提物2，K2HPO414，KH2PO46，（NH4）2SO42，瓊脂粉20，pH 7.2～7.4.

1.1.3 主要試劑

Pyrobest DNA 聚合酶、限制性內切酶、T4，DNA連接酶、DNA Marker和瓊脂糖凝膠回收試劑盒等均購自TaKaRa公司；卡那霉素、PCR產物純化試劑盒、小量DNA產物純化試劑盒、福林酚和酪蛋白等均購自上海生工生物工程有限公司；其他分析純試劑均由北京國藥集團有限公司提供.

1.2 方法

1.2.1 堿性蛋白酶基因的擴增

參照GenBank報道的嗜堿芽胞桿菌TCCC11006菌株堿性蛋白酶apr基因序列（GenBank登錄號：FJ940727.1）設計引物.上游引物為5′-CGC GGATCC GCTGAAGAAGCAAAAGAAAAATAT-3′；下游引物為5′-TCCCCCGGGTTAGCGTGTTGCCGC TTCT-3′.其中在上游引物和下游引物中分別加入BamHⅠ和SmaⅠ酶切位點.PCR反應體系為PyrobestTMDNA聚合酶0.25，μL、10×Pyrobest bufferⅡ（Mg2+Plus）5，μL、dNTP Mixture（2.5，mmol/L）4，μL、模板1，μL、上游引物和下游引物各1，μL、超純水37.75，μL；PCR反應條件為94，℃ 5，min，94，℃ 30，s，55，℃ 30，s，72，℃ 60，s，72，℃ 10，min，15，℃ 60，min.嗜堿芽胞桿菌基因組DNA的提取、質粒DNA的制備等方法參考文獻［13］.

1.2.2 重組質粒pHY-apr的構建、轉化與驗證

將擴增出來的堿性蛋白酶基因片段與質粒pHY分別進行酶切、純化，再進行連接.采用電轉化法將連接產物轉入地衣芽胞桿菌H115中，并在含有20，μg/mL卡那霉素的酪素篩選培養基上對轉化子進行篩選、驗證.

1.2.3 重組菌的驗證

在含有20，μg/mL卡那霉素的酪素篩選培養基上對陽性轉化子進行點接.觀察有無透明圈形成.

1.2.4 重組菌堿性蛋白酶的表達

將驗證正確的重組菌接種到含有20，μg/mL卡那霉素的30，mL LB液體培養基中，37，℃、200，r/min培養過夜后，按照2%的接種量轉接到50，mL LB發酵培養基中進行發酵實驗，每隔8，h取樣，取樣后將發酵液12，000，r/min離心10，min，測定上清液酶活力.

1.2.5 堿性蛋白酶活力的測定

按照GB/T 23527—2009［14］測定酶活力，1個酶活力單位（U）是1，mL酶液在40，℃、pH 10.5條件下反應1，min產生1，μg酪氨酸所需要的酶量.

1.2.6 重組堿性蛋白酶水解酪蛋白工藝參數的確定

酪蛋白水解度的測定采用茚三酮比色法［15］.酪蛋白溶液總氮含量的測定采用微量凱氏定氮法［16］.水解度（DH）按照式（1）進行計算.

式中：c為樣品中氨基的含量，μmol/mL；ρ為底物溶液中總氮含量，mg/mL，6.25×ρ為水解物中蛋白的含量，mg/mL；Htot為1，g原料蛋白質的肽鍵總數，酪蛋白的Htot為8.2，mmol/g.

（1）時間的變化對水解度的影響：用pH為10.5的硼砂-氫氧化鈉緩沖液配制100，mL 2%的酪蛋白溶液，按照2，000，U/g添加重組堿性蛋白酶，在40，℃恒溫水浴鍋中進行水解反應，每隔30，min取樣，研究時間對酪蛋白水解度的影響.

（2）溫度的變化對水解度的影響：pH，10.5的條件下水解2%酪蛋白溶液，重組堿性蛋白酶的添加量為2，000，U/g，水解2，h，測定不同溫度下的水解度.

（3）pH的變化對水解度的影響：在水解溫度為50，℃條件下水解2%酪蛋白溶液，重組堿性蛋白酶的添加量為2，000，U/g，水解2，h，測定不同pH下酪蛋白溶液水解度.

（4）酶添加量的變化對水解度的影響：在pH，10.5、水解溫度50，℃的條件下水解2%酪蛋白溶液，水解2，h，測定不同酶添加量下酪蛋白溶液水解度.

（5）正交實驗優化：在上述單因素實驗的基礎上，選擇水解溫度、pH和酶添加量3個因素，分別取3個水平，并以L9（33）正交表進行正交實驗，通過方差分析篩選出關鍵因素，從而確定最優水解條件組合.其中，正交實驗的設計和分析采用軟件正交實驗助手Ⅱ 3.1.1進行.

1.2.7 酪蛋白磷酸肽的制備與理化性質檢測

在最佳水解條件下，采用鋇-乙醇沉淀法［17］制備CPP.總磷含量的測定參照GB/T 5009.87—2003［18］的鉬藍比色法.測定鋇-乙醇沉淀得到的粗品質量（m1）和初始酪蛋白質量（m2），按照式（2）計算酪蛋白磷酸肽得率.分別測定氮、磷的質量分數（wN和wP），按照式（3）計算氮磷物質的量比.

2 結果與分析

2.1 堿性蛋白酶基因apr的擴增

提取嗜堿芽胞桿菌TCCC11006染色體DNA，以此為模板，apr-F和apr-R為引物PCR擴增堿性蛋白酶基因apr.所擴增片段的大小為1，100，bp左右，與理論值（1，060，bp）相符（圖1）.

圖1 嗜堿芽胞桿菌TCCC11006，apr基因的PCR擴增Fig. 1Amplification of apr gene encoded alkaline protease from B. alcalophilus TCCC11006

2.2 重組質粒pHY-apr的構建

將PCR獲得的片段經過BamHⅠ酶切后，與經過BamHⅠ和SmaⅠ酶切的表達載體pHY連接，采用電擊轉化方法轉入感受態細胞中，在含有卡那霉素的干酪素平板上篩選轉化子.其中，重組載體pHY-apr的構建方案如圖2所示.

圖2 重組表達質粒的構建示意圖Fig. 2Diagram of the construction of the recombined plasmid

2.3 重組菌的篩選和鑒定

重組質粒經BamHⅠ和SmaⅠ雙酶切后得到兩條大小分別為4.6，kbp和1.1，kbp的條帶（圖3），表明目的基因已經插入到pHY載體上，將該重組子命名為pHY-apr.

圖3 重組質粒的酶切鑒定Fig. 3 Identification of recombined plasmid through double digestion with BamHⅠ and SmaⅠ

2.4 重組菌驗證

將含有目的基因的載體與不含目的基因片段的空載轉入地衣芽胞桿菌后，得到的轉化子分別在酪素篩選培養基中進行點接，培養32，h，結果如圖4所示.

圖4 重組菌鑒定Fig. 4 Identification of the recombined bacteria

2.5 重組菌與出發菌株的產酶水平比較

在發酵過程中，每隔8，h進行取樣，測定上清液酶活力.重組菌H115/pHY-apr在LB發酵培養基中發酵56，h時，酶活力達到最大，為3，199，U/mL；而出發菌株TCCC11006在發酵64，h時酶活力僅為1，758，U/mL（圖5）.

圖5 重組菌與出發菌株發酵酶活的比較Fig. 5 Comparison of the activities of alkaline proteases from the recombined strain and the starting strain

2.6 重組堿性蛋白酶水解酪蛋白工藝條件的確定

2.6.1 時間的變化對水解度的影響

重組堿性蛋白酶水解2%酪蛋白溶液時，其水解度（DH）隨著時間的變化趨勢如圖6所示.由圖6可知，水解時間為0.5～2，h，水解度隨著時間的增加而變大.當水解時間為2，h時，水解度達到15.6%.繼續增加水解時間，水解度保持不變.

圖6 不同時間段酪蛋白水解度比較Fig. 6 Effects of time on the hydrolysis of casein

2.6.2 溫度對水解度的影響

不同溫度下，酪蛋白水解度的變化如圖7所示.在35～50，℃的溫度范圍內，酪蛋白的水解度隨著溫度的增高而變大.當溫度達到50，℃時，蛋白酶的水解度達到17.9%.繼續增加溫度，水解度反而降低.

圖7 溫度對水解度的影響Fig. 7 Effects of temperature on the degree of hydrolysis

2.6.3 pH對水解度的影響

不同pH對水解度的影響如圖8所示.當反應pH達到9.5時，其水解度最大，為17.6%.但是，隨著反應pH增大或減小，其水解度均逐漸變小.

2.6.4 酶添加量對水解度的影響

不同酶添加量對水解度的影響結果如圖9所示.在一定量的酶添加量的范圍內，酪蛋白的水解度隨著酶量的增加而變大.添加量在1，000～4，000，U/g范圍內，水解度變化較明顯，但是繼續增加酶的添加量時，其水解度基本保持不變.

圖8 pH對水解度的影響Fig. 8 Effects of pH on the degree of hydrolysis

圖9 酶添加量對水解度的影響Fig. 9 Effects of the amount of enzyme on the degree of hydrolysis

2.6.5 正交實驗

根據單因素實驗結果，選取溫度（A）、pH（B）、酶添加量（C）進行正交實驗設計，進一步考察各因素對酪蛋白水解度的影響.正交實驗結果見表1.

表1 水解度正交實驗的因素水平和結果Tab. 1 Factors，levels and results of orthogonal experiment of the degree of hydrolysis

由表1可知，影響酪蛋白水解度的顯著性大小的順序為A＞C＞B.通過正交實驗確定了最佳水解條件為：水解溫度50，℃，pH，9.5，酶添加量4，000，U/g.

2.7 酪蛋白磷酸肽的制備

2.7.1 酪蛋白磷酸肽得率

參照鋇-乙醇沉淀法制備酪蛋白磷酸肽，用2，g固體酪蛋白經過重組堿性蛋白酶在其最佳水解條件下進行水解，經過烘干后，得到酪蛋白磷酸肽粗品的質量為0.296，g，得率為14.8%.

2.7.2 酪蛋白磷酸肽氮磷物質的量比

按照酪蛋白磷酸肽含氮量和含磷量測定方法進行測定，酪蛋白磷酸肽中氮含量為11.9%，磷含量為3.11%，氮磷物質的量比為8.47.

3 討 論

本研究將堿性蛋白酶基因apr成功導入地衣芽胞桿菌H115中，并實現了分泌表達，在LB液體培養基（50，mL/250，mL）中進行搖瓶發酵，其最大酶活力為3，199，U/mL，是出發菌株酶活的1.82倍，同時發酵周期較出發菌株縮短了8，h，為堿性蛋白酶的大規模生產奠定了一定的基礎.

酪蛋白磷酸肽作為功能性食品的添加劑，日益受到人們的關注.目前，CPP的生產主要依賴于動物源的胰蛋白酶，但是價格昂貴、提取較復雜、得率較低等一系列因素［19］，使得胰蛋白酶在CPP的大規模生產和應用方面受到限制.本研究中，利用微生物源的蛋白酶制備CPP，其中，用重組堿性蛋白酶水解2%酪蛋白溶液時，隨著水解時間的逐漸增加，其水解度也不斷增加，當水解時間達到2，h后，其水解度基本維持在15.8%左右；由于蛋白酶對溫度和pH比較敏感，研究發現，重組堿性蛋白酶在50，℃、pH為9.5時，其水解度較大，可能原因是重組堿性蛋白酶在溫度和pH不適宜的環境下，其穩定性差有所降低，使重組酶受到不同程度的影響，導致水解度的降低［20］；另外，由于酶與底物的結合是有一定限制的，所以對其酶添加量進行研究發現，酶添加量在4，000，U/g時，其水解度達到最大，所以本研究最終獲得的最佳水解條件是水解時間2，h，水解溫度50，℃，水解pH為9.5，酶添加量為4，000，U/g.

利用重組堿性蛋白酶在其最優水解條件下水解酪蛋白制備CPP，CPP的得率為14.8%，氮磷物質的量比為8.47，雖然得率與胰蛋白酶的17%相比稍有差距［19］.但是，本研究利用微生物源蛋白酶制備的CPP，具有更低的氮磷物質的量比，純度更高，磷酸絲氨酸基團更容易得到富集，使得其結合鈣離子的能力越強，阻止鈣離子沉淀的效果越好.這為其替代胰蛋白酶制備CPP以及在其他功能性食品的制造方面打下了堅實的基礎.

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責任編輯：郎婧

Heterologous Expression and Application of Gene Encoded Alkaline Protease in Preparation of CPP

LING Min1，DONG Zixing2，LI Yu1，YE Song1，WANG Zhengxiang2，LU Fuping1
（1. College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；
2.College of Chemical Engineering and Materials Science，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

Alkaline protease is one of the most important enzymes in industrial enzymes.It plays a very important role in human daily life.Alkaline protease encoded gene（apr）was amplified from B.alcalophilus TCCC11006，genome.Then the recombined expression vector pHY-apr was successfully constructed and transformed into protease-deficient strain B.licheniformis H115.The alkaline protease gene was expressed in the recombined B.licheniformis H115.The highest alkaline protease activity was 3，199，U/mL in LB medium，which was 1.82，times of that of the starting strain.The fermentation cycle was decreased by 8，h.Then the hydrolyzing casein paramenters of recombined alkaline protease were optimized with single factor and orthogonal experiments.The optimum hydrolyzing time，temperature，pH and the amount of the enzyme were found to be 2，h，50，℃，9.5，and 4，000，U/g substrate.Under the optimal hydrolysis conditions，the yield and N/P mole ratio of the casein peptide phosphate（CPPs）prepared were 14.8% and 8.47，respectively.Knowledge gained in the research can be a solid foundation for the application of alkaline protease in the manufacturing of functional food.

alkaline protease；cloning expression；hydrolysis；CPP

TQ920.6

A

1672-6510（2016）05-0008-06

10.13364/j.issn.1672-6510.20150217

2015-11-25；

2016-02-05

國家高技術研究發展計劃（863計劃）資助項目（2013AA102106-07）

凌 敏（1990—），男，安徽合肥人，碩士研究生；通信作者：路福平，教授，lfp@tust.edu.cn.

數字出版日期：2016-05-19；數字出版網址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1355.N.20160519.1033.008.html.