內蒙古地區單純性病理性近視患者Decorin基因突變篩查

馮月蘭，董 竟，劉志英，唐靜曉

·臨床報告·

內蒙古地區單純性病理性近視患者Decorin基因突變篩查

馮月蘭，董 竟，劉志英，唐靜曉

Department of Ophthalmology，the First Affiliated Hospital of Baotou Medical College，Baotou 014010，Inner Mongolia Autonomous Region，China

Correspondence to:Yue-Lan Feng.Department of Ophthalmology，the First Affiliated Hospital of Baotou Medical College，Baotou 014010，Inner Mongolia Autonomous Region，China.fyl-2006-ky @163.com

·AIM:To investigate the relation of Decorin（DCN）gene and simple pathological myopia in Inner Mongolia region.

·METHODS:GenomicDNAwascollectedfrom 100 control subjects and 100 patients with simple pathological myopia.The exon7 and exon8 and the flanking intron regions of DCN gene were analyzed by polymerase chain reaction（PCR）and direct sequencing.The relation of Decorin gene exon7 and exon8 with simple pathological myopia was statistically analyzed.

·RESULTS:In simple pathological myopia group，2 patients'gene mutations were identified.Both was 41775T→C，located at the flanking intron regions of exon8.No variation was found in others including control group. Thegenemutationbetweencontrolsandsimple pathological myopia groups were not different（P＞0.05）.

·CONCLUSION:DNC gene exon7 and exon8 mutation may not be the disease gene in this group in Inner Mongolia region.

目的：研究內蒙古地區單純性病理性近視患者核心蛋白聚糖（Decorin，DCN）基因與高度近視的關系。

方法：收集單純性病理性近視患者血液100例，視力正常者血液100例作為對照組，提取全血基因組DNA，應用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）方法分別擴增DCN基因第7、第8個外顯子及其鄰近內含子并進行測序分析。統計學分析研究DCN基因外顯子7、8的突變位點與單純性病理性近視的相關性。

結果：單純性病理性近視患者100例中發現有2例發生突變，均為41775T→C，位于外顯子8的鄰近內含子區域，其余均未發現任何突變。與正常組對比差異無統計學意義（P＞0.05）。

結論：內蒙古地區單純性病理性近視患者的DCN基因外顯子7、8突變與本組高度近視無關。

單純性病理性近視；核心蛋白聚糖基因；突變

引用：馮月蘭，董竟，劉志英，等.內蒙古地區單純性病理性近視患者Decorin基因突變篩查.國際眼科雜志2016；16（3）:579-581

0　引言

病理性近視（pathological myopia，PM）又稱變性近視，是因為眼軸過度增長而造成眼底后極部損害為特征的高度近視［1］，其特點為眼軸異常延長，近視度數持續進行性加深，且發展快，成年后會相對變慢或靜止；通常伴有后鞏膜葡萄腫、眼底退行性變性、視網膜脫離、白內障、青光眼、弱視、玻璃體混濁及黃斑出血等嚴重并發癥的一類近視。單純性病理性近視為不伴有全身其他疾病的高度近視。單純性高度近視的病因不明，定位于12q23內的核心蛋白聚糖DCN基因被認為是“最可能”的高度近視候選基因［2］，它在細胞外基質中表達蛋白聚糖中的蛋白質部分。蛋白聚糖可以與膠原蛋白相互作用限制纖維的增長，與鞏膜的正常生長發育密切相關，對鞏膜的生長及代謝也起著重要的調節作用。我們采用PCR、基因測序的方法在內蒙古地區單純性病理性近視患者群體中進行DCN基因突變篩查，分析其與單純性病理性近視的關系。

1　對象和方法

1.1對象 選取單純性病理性近視患者100例，為2011-09/2014-12年就診于內蒙古科技大學附屬第一醫院眼科的病理性近視患者，納入標準:（1）經散瞳驗光確定雙眼屈光狀態≥-6.00D，A型超聲測量儀測眼軸長度≥26mm；（2）青少年時期屈光度發展迅速且持續性加深，成年后發展速度變慢或相對靜止；（3）眼底具有特征性改變:如后鞏膜葡萄腫、豹紋狀眼底、近視弧形斑、黃斑部病變等（兒童可無上述改變）；（4）無全身性疾病。排除標準:（1）排除眼外傷及手術史；（2）排除因其他眼科疾病而并發的病理性近視；（3）排除患有全身性疾病的患者，如高血壓病、糖尿病等。正常對照組100例，納入標準:（1）電腦驗光儀測屈光度:＜±0.50D（等值球鏡）。（2）A型超聲測量儀測眼軸長:＜26mm。（3）不伴病理性近視眼底改變。所有研究對象均無其它遺傳病，均為內蒙古地區漢族。

1.2方法

1.2.1DNA提取及基因擴增 抽取患者的外周靜脈血，應用DNA提取試劑盒（Axygen公司）提取全血基因組DNA。根據DCN基因的序列設計2對引物，外顯子7: AGAAAGGCATCCATGTGTGG/TGTACTTATGCTCTGCCAG（185bp，56℃）；外顯子8:ATTATTTTCTATCGTTTCATGTTG/ AATGAGGGCTTTCTTGAGAA（242bp，56℃）（引物序列后為片段長度和復性溫度）。應用PCR分別擴增DCN基因2個外顯子及其鄰近內含子，PCR產物經2%瓊脂糖電泳，于紫外光下檢測電泳結果。

1.2.2PCR產物測序 將PCR擴增產物送invitrogen公司進行正向和反向測序反應分析，利用DNAstar 7.1軟件將雙向測序的結果進行拼接，得到完整序列。使用DNAstar 7.1軟件將拼接后的序列與在GenBank中查到的DCN序列（NG_011672.1）進行比對。

統計學分析:運用SPSS 17.0軟件包建立數據庫。采用卡方檢驗和Fisher雙側確切概率檢驗進行統計學分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

圖1　DCN外顯子7擴增電泳圖 M:100bp Lander Marker；1～5:DCN外顯子7擴增產物。

圖2　DCN外顯子8擴增電泳圖 M:100bp Lander Marker；1～5:DCN外顯子8擴增產物。

圖3　外顯子7擴增產物測序圖。

圖4　外顯子8正常測序圖。

圖5　外顯子8突變測序圖。

2　結果

2.1PCR擴增 所有病理性近視患者和正常對照組均擴增出目的條帶。Decorin第7外顯子片段長度為185bp，外顯子8片段長度為242bp，PCR擴增的DNA產物大小與引物設計吻合（見圖1、2）。

2.2DNA測序結果分析 使用DNAstar 7.1軟件將雙向測序的結果進行拼接，將拼接后的序列進行比對，分析突變位點。DCN基因外顯子7在單純性病理性近視組和對照組中均未發現突變位點如圖3所示（任選部分所測序列圖譜）。在病理性近視組有2個病例發現突變位點，均為41775T→C，位于外顯子8的鄰近內含子區域，如圖4（正常外顯子8測序圖）、圖5所見（外顯子8發生突變位點測序圖），其余病理性近視組患者和正常對照組患者均未發現基因突變位點。經統計學分析單純性高度近視組與對照組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。

3　討論

近視的發病主要受環境因素與遺傳因素影響，環境因素如近距離作業、閱讀時間過長、閱讀時距離過短、閱讀時照明光線過強或過弱等，但遺傳因素在近視的發病中也起著舉足輕重的作用。雖然病理性近視的遺傳學研究取得了很大進展，現已成功鑒定出病理性近視的多個易感基因及遺傳連鎖位點，但是要鑒定其致病基因還有一定難度。1998年Young等［2］對1個德國/意大利族混血常染色體顯性遺傳的高度近視的大家系進行連鎖分析和全基因組掃描分析確定了常染色體顯性遺傳單純高度近視的兩個基因位點:18p11.31（MYP2）和12q21-23（MYP3），Nürnberg等［3］對一個6代德國高度近視家系進行基因芯片研究，該家系在MYP3基因處12q14.3-12q21.31區域顯示出高度連鎖。Li等［4］對來自254個家系共1411個研究對象進行了全基因組掃描，在12號染色體q21.2-24.12（36.59 cM）區域得到了3.48的最高LOD值。可見MYP3基因在更多的家系中得到了驗證。DCN基因定位于12q23恰位于該區域內，該基因由8個外顯子和7個內含子構成［5-6］，其編碼的核心蛋白聚糖是一種隸屬于富含亮氨酸的小分子蛋白聚糖（the small leucine-rich repeat proteins，SLRPs）家族的細胞外蛋白。SLRPs被認為與鞏膜和玻璃體的膠原纖維構成有關，眼球的形狀絕大部分取決于鞏膜和玻璃體，所以SLRP家族的缺陷可能會導致近視。核心蛋白聚糖在人鞏膜組織中的表達已經得到了證實［7-8］，其在鞏膜組織中含量的改變和分布排列的異常將會影響鞏膜組織的結構與功能。內蒙古自治區地處內蒙古高原，空氣稀薄，日照時間長，且常年低壓缺氧，尤其太陽光中的強紫外線輻射甚至可誘發基因突變。我們對內蒙古地區100個單純性病理性近視者的DCN基因進行了分析，發現其中有2例患者出現基因突變，均為41775T→C，位于外顯子8的鄰近內含子區域，其余正常對照組患者均未發現基因突變位點。與對照組比較單純性高度近視組外顯子8鄰近內含子區域出現的基因突變頻率較低，經統計學分析組間無差異（P＞0.05）。分析可能是新出現的單核苷酸多態。本研究未發現DCN的第7、第8外顯子在單純性高度近視患者中存在突變，可以初步排除DCN基因第7、第8外顯子與本組高度近視的相關性。雖然突變區域位于內含子區域，不編碼蛋白質，但是內含子的堿基改變也可以對基因表達進行調節，可能影響蛋白質的結構或功能。故不能完全否認DCN基因是高度近視致病基因的可能性。關于單純性高度近視的致病基因有待于進一步擴大樣本量并在其他外顯子中繼續查找。

1胡誕寧，褚仁遠，呂帆，等.近視眼學.北京:人民衛生出版社2009: 225-277

2 Young TL，Ronan SM，Alvear AB，et al.A second locus for familial high myopia maps to chromosome 12q.Am J Hum Genet 1998；63（5）: 1419-1424

3 Nürnberg G，Jacobi FK，Broghammer M，et al.Refinement of the MYP3 locus on human chromosome 12 in a German family with Mendelian autosomal dominant high-grade myopia by SNP arraymapping. Int J Mol Med 2008；21（4）:429-438

4 Li YJ，Guggenheim JA，Bulusu A，et al.An international collaborative family-based whole-genome linkage scan for high-grade myopia.Invest Ophthalmol Vis Sci 2009；100（7）:3116-3127

5 Danielson KG，Fazzio A，Cohen I，et al.The human decorin gene: intron-exon organization，discovery of two alternatively spliced exons in the 5-prime untranslated region，and mapping of the gene to chromosome 12q23.Genomics 1993；15（10）:146-160

6 Vetter U，Vogel W，Just W，et al.Human decorin gene:intron exon junctions and chromosomal localization.Genomics 1993；15（8）:161-168

7 Young TL，Scavello GS，Paluru PC，et al.Microarray analysis of gene expression in human donor sclera.Mol Vis 2004；10（10）:163-176

8 Young TL，Guo XD，King RA，et al.Identification of genes expressed in a human scleral cDNA library.Mol Vis 2003；9（1）:508-514

Screening for mutation of Decorin gene in simplepathologicalmyopiainInner Mongolia region

Yue-Lan Feng，Jing Dong，Zhi-Ying Liu，Jing-Xiao Tang

2015-10-27 Accepted:2016-02-14

simplepathologicalmyopia；Decorin gene；mutation

（014010）中國內蒙古自治區包頭市，包頭醫學院附屬第一醫院眼科

馮月蘭，碩士，主治醫師，研究方向:眼表疾病及眼視光。

馮月蘭.fyl-2006-ky@163.com

2015-10-27

2016-02-14

Feng YL，Dong J，Liu ZY，et al.Screening for mutation of Decorin gene in simple pathological myopia in Inner Mongolia region.Guoji Yanke Zazhi（Int Eye Sci）2016；16（3）:579-581

10.3980/j.issn.1672-5123.2016.3.51