兔自體富血小板血漿對兔ACL重建后腱骨愈合的影響

李 洋，徐 斌，徐洪港，涂 俊，楊軍軍

兔自體富血小板血漿對兔ACL重建后腱骨愈合的影響

李 洋，徐 斌，徐洪港，涂 俊，楊軍軍

目的 探討兔自體富血小板血漿（PRP）對前交叉韌帶（ACL）重建后腱骨愈合的作用。方法 選取30只新西蘭大白兔，兔齡體重相仿，隨機均分為實驗組和對照組。實驗組每只抽取自體全血，二次離心法獲得PRP。實驗組移植入PRP和生物蛋白凝膠復合物；對照組移植入生物蛋白凝膠。分別于4、8、12周3個時間點處死5只兔子取材，3只用于骨道內移植物抗拉力試驗，采用獨立樣本t檢驗比較；2只用于觀察形態學，對上述3個時間點的兩組標本分別行腱骨界面Buark評分，采用Wilcoxon秩和檢驗，觀察ACL重建術后腱骨愈合的情況。結果 Masson三色染色顯示實驗組術后8周前膠原纖維增生不明顯，排列混亂，8周后開始到12周膠原纖維開始大量增生，排列逐漸有序；而對照組8周及12周只見到少量排列無序的膠原纖維。移植物抗牽拉實驗顯示實驗組和對照組的股骨道移植物抗牽拉強度與時間長度呈正比，由8周開始PRP組明顯強于對照組（P＜0.01）。結論 PRP對腱骨界面膠原纖維形成以及生物力學強度有促進作用。

前交叉韌帶；富血小板血漿；腱骨愈合

隨著全民健身的普及和各種意外事故的頻繁發生，涉及膝關節前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）的運動損傷越來越常見，人們對于運動損傷，特別膝關節韌帶損傷的認識也在逐漸加深，進一步治療的需求也在不斷加強，膝關節ACL損傷后的治療面臨著極大的考驗。膝關節是全身中結構最復雜的關節，同時也是受杠桿作用最強以及損傷最多的關節［1］。膝關節的交叉韌帶是穩定膝關節的重要結構，一旦交叉韌帶出現損傷，膝關節的各種問題（包括關節不穩定、半月板損傷、骨性關節炎等）可能會接踵而至，短期內膝關節會喪失穩定性，個體會暫時失去一些基本的行走跑跳功能，膝關節就不能滿足日常生活和運動的需求，長期來說就會給膝關節造成完全不可逆的破壞，所以ACL損傷的修復重建一直是骨科和運動創傷領域重要的研究方向之一［2］。隨著關節鏡微創技術的不斷發展，膝關節鏡下ACL重建技術日趨成熟，但是對于重建后，腱骨愈合所能達到的程度依然是研究的熱點［3］。關于移植物在骨道內愈合因素的研究包括物理機械干擾、生物因素刺激、干細胞移植和富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）及其生長因子等多個方面［4］。該研究探討PRP對ACL重建術后腱骨愈合是否有促進作用。

1 材料與方法

1.1 PRP的提取與鑒定 本實驗所使用是國際上較公認的Landesberg法［5］，取實驗組動物的全血8 ml于離心管中，以1 400 r/min離心10 min，吸取全部的上清液達交界平面下3 mm，將吸取液移入另一無菌離心管中，再以1 400 r/min離心10 min，吸棄上清液，留適量血漿以容納并稀釋高濃度的血小板。

1.2 動物模型的建立 于安徽醫科大學實驗動物中心分批購買30只新西蘭大白兔，兔齡3～4個月，按實驗要求隨機分為PRP組和對照組，每組15只，所有實驗動物取右后肢行ACL重建術。造模：麻醉后備皮，碘酒消毒后鋪巾，小腿后方酒精擦皮后作縱行切口，逐層分離取適合長度的趾長屈肌腱，關閉取腱口。將肌腱對折，使用4-0無菌縫合線縫合游離端，另一端用1.0 mm鋼絲穿過，移植肌腱用無菌生理鹽水紗布包裹備用。以髕骨為中心，沿膝關節內側髕旁入路，依次切開皮膚、筋膜及內側支持帶，將髕骨外置做脫位狀態，充分暴露膝關節腔，剪斷ACL，建立ACL損傷模型后，檢查前抽屜試驗及拉赫曼實驗均顯示陽性結果。將兔膝關節置于90°，沿原ACL股骨及脛骨止點處，使用2.5 mm克氏針建立脛骨與股骨隧道，于股骨髁上方約1.5 mm處由1.0 mm克氏針建立兩處骨道，用于肌腱股骨端鋼絲固定，自脛骨端向股骨端穿鋼絲引入移植肌腱，股骨端由鋼絲穿過預留的1.0 mm股骨骨道，達于內側螺旋擰緊固定，將PRP凝膠均勻注入實驗組兔子的股骨隧道，對照組兔子的股骨隧道僅注入單純凝膠，脛骨端肌腱拉緊并與周圍軟組織緊密縫合固定。復位髕骨，再次檢查前抽屜試驗及拉赫曼試驗，結果陰性。無菌生理鹽水沖洗關節腔，逐層縫合，無菌敷料包扎，右膝關節30°長腿石膏固定兩周。待蘇醒后送回安徽醫科大學動物飼養中心，實驗動物于術后抗生素肌注3 d以預防感染，每日觀察實驗動物的術后情況，實驗動物傷口未見紅腫等感染，存活至標本取材階段。

1.3 標本的制備及組織學觀察 在術后第4、8、12周每組各處死5只實驗動物，去除肌肉等軟組織，保留完整韌帶結構的右膝關節，其中3只用于股骨端移植物抗牽拉力試驗，2只用于Masson三色染色。將用于染色的完整膝關節使用10%中性福爾馬林溶液固定72 h，后于10%EDTA磷酸緩沖液脫鈣4～6周，用石蠟儀制成石蠟切片，Masson染色后作形態學觀察。

1.4 統計學處理 采用SPSS 20.0軟件進行分析，數據以表示，Buark評分數據采用有序分類兩組獨立樣本的Wilcoxon秩和檢驗，兩組間采用兩樣本t檢驗。

2 結果

2.1 組織標本觀察

2.1.1 膝關節標本的觀察 PRP組及對照組4周時間點標本關節腔可見血性積液，未見膠體殘存，可見滑膜大量增生，軟骨無明顯破壞，移植肌腱走形正常，張力可，不松弛、無斷裂。8周及12周時間點PRP組及對照組膝關節積液量明顯減少，PRP組可見大量滑膜組織，對照組滑膜組織較PRP組略少，兩組的骨髓道外口均出現類骨樣組織，內口可見瘢痕組織。

2.1.2 Masson三色染色觀察 術后4周：對照組仍可見大量壞死組織，只有少量成纖維細胞出現，無明顯膠原纖維生成，并且纖維排列錯亂。PRP組壞死組織相對較少，可見少量成纖維細胞，開始見膠原纖維長入，組織排列仍然無序。術后8周：對照組可見大量成纖維細胞，腱骨愈合界面有少量膠原纖維長入，纖維排列依然欠規則。PRP組可見大量成纖維細胞，腱骨愈合界面有大量膠原纖維長入，大部分纖維開始呈現整齊有序排列，但仍有少量纖維無序生長。術后12周：對照組成纖維細胞數量變少，而膠原纖維生成增多，成纖維細胞與膠原纖維于腱骨愈合交界處分布相仿。PRP組成纖維細胞數量明顯減少，僅殘余少量成纖維細胞，腱骨愈合交界處可見大量膠原纖維規則排列。見圖1。

圖1 不同時間點腱骨界面Masson三色染色 ×100

2.2 兩組標本的Buark評分 依據實驗動物標本腱骨界面的組織形態學，測量腱骨界面一定長度中Sharpey纖維占有頁面的百分比以及腱骨界面的纖維血管組織的分布情況。Buark評分有以下4層標準：① Grade I缺乏組織結構的疏松纖維血管組織界面；②Grade II已機化的纖維血管組織伴有膠原纖維產生，占有的界面長度＜30%；③Grade III成熟的纖維組織，細胞和血管減少，占有的界面長度30%～60%；④ Grade IV纖維血管組織機化成致密結締組織，垂直于骨道方向的Sharpey纖維占有的界面長度＞60%。12周內PRP組與對照組組織形態學Buark評分差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.3 股骨道移植物抗牽拉試驗 如圖2所示將預處理好的離體膝關節固定于測試架上，股骨和脛骨分別固定于測試架上方和下方，保持膝關節90°位，將合適大小的鋁板貼附于脛骨結節后方，并用鋼絲固定，連接至拉力計，先用4 N拉力預張移植物，再均勻施加牽拉力，直至使移植物由骨道內脫出，記錄此時的拉力數值。詳細記錄兩組肌腱脫出骨道內時拉力的大小。實驗組和對照組的股骨道移植物抗牽拉強度與時間長度呈正比，由8周開始PRP組明顯強于對照組（P＜0.01）。見表2。

表1 兩組標本的組織形態學Buark評分

圖2 股骨道移植物抗牽拉強度試驗

表2 術后3個時間段兩組移植物股骨道內抗牽拉強度數據對比（單位：N）

3 討論

中國每年每10萬人中就有38例ACL損傷的患者［5］，運動員中比例更高，每年接受韌帶重建的手術患者也在逐漸增多，運動醫學也越來越受到大家的重視。隨著技術的不斷進步和手術器械的研制創新，關節鏡下ACL重建手術已經成為現代治療膝關節交叉韌帶損傷的主流方法［6］。關節鏡下重建ACL有療效確切、創傷小、恢復快以及并發癥少等優點［7］，但是術后移植物如何更好地融入患者的膝關節，如何最大程度的替代ACL的功能依然是研究的熱點［8］。

Friedman在1988年最早描述關節鏡下采用自體半腱肌肌腱重建ACL［6］。從此開始了對ACL重建手術的研究。從選擇自體半腱肌肌腱到自體腘繩肌肌腱的單股，再到后來的自體半腱肌肌腱聯合自體股薄肌肌腱的四股。由自體移植物到異體移植物的選擇，再到近年來出現的人工韌帶，還有固定技術、導航技術也日新月異、日趨成熟［9］。隨著科技的進一步發展，研究開始向細胞水平轉移，PRP是富含血小板的血漿，通過血小板里的α顆粒釋放的生長因子和細胞因子可以促進移植物的成熟。有研究［10］表明，在ACL移植物成熟過程中，PRP可以增強細胞活力，促進膠原蛋白（Ⅰ型和Ⅲ型）的表達。PRP可以在一個較早時間點內促進細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的合成和腱骨愈合。最近，在一些ACL重建手術中，PRP已經被用來加速移植肌腱的成熟過程［5，11］。然而，PRP對肌腱移植物重塑過程中ECM的合成與降解的影響并不十分清楚［12］。PRP含有與創傷愈合、骨再生相關等多種生長因子，如轉化生長因子、血小板衍生生長因子、胰島素樣因子、血管內皮生長因子和表皮生長因子［3，13］。PRP在局部組織的修復中發揮著重要作用，其具有的高效誘導活性，且又不易引起免疫排斥反應，可以釋放大量細胞因子及生長因子，大幅度提高細胞的增殖分化能力，并促進各種ECM的合成，加快加強腱骨愈合的進程［14］。以上形態學實驗顯示4～8周后PRP組壞死組織明顯減少，大量成纖維細胞及膠原纖維長入，排列規則、整齊，明顯好于對照組；股骨骨道內移植物抗拉力試驗同樣顯示PRP組強度要明顯強于對照組。

ACL重建技術已經十分成熟，但是重建后移植物腱骨愈合的好壞、功能恢復的快慢依然是研究的熱點。PRP的眾多優點也決定著其擁有廣闊的前景。本實驗以組織形態學以及生物力學兩個方面同時證實了PRP在移植物重建后對腱骨愈合確實有促進作用，但是因PRP本身的復雜性，具有多種豐富的生長因子，本實驗未能進一步探索各個因子之間的相互作用關系，希望遠期研究可以進一步發現PRP中各個因子的單獨作用，使PRP得到更好的應用前景。

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Effect of platelet rich plasma on the healing of tendon bone after reconstruction of rabbit ACL

Li Yang，Xu Bin，Xu Honggang，et al
（Dept of Sports Injury and Arthroscopic Surgery，
The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

Objective To investigate the effect of autologous platelet rich plasma（PRP）in tendon bone healing after reconstruction of the anterior cruciate ligament（ACL）.Methods 30 New Zealand rabbits were randomly divided into the experimental group and the control group（n=15 per group）.In the experimental group the platelet rich plasma was obtained by the method of two-step centrifugation，and the experimental group was implanted with PRP and fibrin gel and the control group received gel only.The 5 rabbits in each group were retrieved at 4th，8th and 12th week，All animals for gross observation at first，then three rabbits were used for biomechanical testing，Two rabbits for the pathological observation，the staining results were scored using the BUARK.Results 8 weeks after operation，the collagen fiber hyperplasia was not obvious in the experimental group，and the arrangement was in disorder.From the 8th week to the 12th week of the experimental group，the collagen fibers began to proliferate，the arrangement became more ordered.In the control group，only a small amount of collagen fibers were found in the 8th and 12th week.In the experimental group and the control group，the maximum biomechanical pull-out strength of the autograft in the femur tunnel was proportional to the repair time，and the experimental group was significantly stronger than that in the control group at the beginning of 8th weeks（P＜0.01）.Conclusion PRP can promote the formation of collagen fibers and the mechanical strength of the tendon bone interface.

anterior cruciate ligament；platelet rich plasma；tendon bone healing

R 686.5

A

1000-1492（2016）09-1277-04

時間：2016-8-1 14：07

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160801.1407.020.html

2016-05-04接收

安徽省自然科學基金（編號：1208085MH157）

安徽醫科大學第一附屬醫院運動創傷與關節鏡外科，合肥230032

李 洋，男，碩士研究生；徐 斌，男，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：youchen100@126.com