miR326調控Ets-1表達及Th17細胞分化參與SLE發病

戴 超，陶金輝，孫曉歌，方 璇，金 莉，項 楠，張 敏，厲小梅，李向培

miR326調控Ets-1表達及Th17細胞分化參與SLE發病

戴 超，陶金輝，孫曉歌，方 璇，金 莉，項 楠，張 敏，厲小梅，李向培

目的 檢測系統性紅斑狼瘡（SLE）患者CD4+T細胞中miR326、E26轉錄因子-1（Ets-1）表達量及Th17細胞比例，分析三者之間的相關性及與狼瘡活動度、系統受累情況的關聯，探討SLE可能的致病機制。方法 選取符合2009年美國風濕病學會診斷標準的SLE患者40例，記錄臨床資料，選取無自身免疫性疾病的健康志愿者14例。流式細胞術檢測 Th17（CD4+IL-17A+）/CD4+T細胞比例，磁珠分選CD4+T細胞、RT-PCR法檢測CD4+T細胞中Ets-1 mRNA及miR326的相對表達量。結果 SLE組 CD4+T細胞中miR326水平高于對照組（P=0.003），活動組高于穩定組（P =0.000）；SLE組Ets-1的表達水平低于對照組（P=0.002），活動組低于穩定組（P=0.001）；SLE組Th17細胞比例較對照組增高（P=0.004），活動組高于穩定組，差異有統計學意義；SLE患者miR326表達量與Ets-1表達量呈負相關性（P＜0.001），與Th17細胞比例呈正相關性（P=0.001）；Ets-1與Th17細胞比例呈負相關性（P=0.003）；SLE患者miR326的表達量及Th17細胞比例與SLEDAI評分呈正相關性（P＜0.001），Ets-1與SLEDAI評分呈負相關性（P＜0.001）；SLE患者miR326水平及Th17細胞比例在皮疹、發熱、血液系統及腎臟受累的患者中增高，Ets-1的表達量則降低；miR326水平及Th17細胞比例與抗dsDNA、抗核小體呈正相關性，與C3、C4呈負相關性，Ets-1與抗dsDNA、抗核小體呈負相關性，與C3、C4呈正相關性。結論 SLE患者CD4+T細胞中miR326表達明顯增高并與Th17細胞比例、疾病活動指標呈正相關性，與Ets-1呈負相關性，提示miR326可能通過抑制Ets-1基因表達，促進Th17細胞分化參與SLE疾病活動。

系統性紅斑狼瘡；微小RNA；Ets-1；Th17細胞

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種典型的多系統炎癥性自身免疫性疾病，以多種自身抗體及免疫復合物引起的組織和器官的損傷為特征，其發病機制尚不完全清楚。Th17（T helper cell 17）細胞是一種以分泌IL-17（interleukin 17）為主的CD4+T細胞亞群。大量實驗顯示，Th17細胞及其相關細胞因子與SLE的發病以及疾病的活動度密切相關［1］。E26轉錄因子-1（E26 transformation specific-1，Ets-1）能夠調控Th17細胞在內的多種細胞的增殖及分化，進而參與自身免疫性疾病的發生與發展［2］。研究［3］證實Ets-1缺陷鼠的Th細胞比野生型鼠的Th細胞向Th17細胞分化增多，提示Ets-1是Th17細胞分化的負性調節因子，Ets-1缺陷會導致Th17細胞相關應答的異常。miR326是課題組前期運用生物信息學方法篩選出的以Ets-1為靶基因的miRNA，研究［4］表明SLE患者外周單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中Ets-1 mRNA及miR326表達異常，該研究通過檢測SLE患者CD4+T細胞中miR326及Ets-1 mRNA的表達水平及Th17細胞比例，分析三者之間的相關性及與狼瘡活動程度、系統受累情況及實驗室指標的關聯，探討三者在SLE疾病活動中的作用。

1 材料與方法

1.1 病例資料 采用病例對照的研究方法，選取2014年4月～12月于安徽醫科大學附屬省立醫院風濕免疫科住院部及門診就診的40例SLE患者，女35例，男5例；年齡18～64（36.00±12.58）歲，所有患者符合美國風濕病學院（ACR）2009年修訂的SLE診斷標準。根據SLE疾病活動指數（systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI）將SLE患者分為活動組（SLEDAI≥5分）21例，穩定組（SLEDAI＜5分）19例。SLE患者的SLEDAI平均評分為（7.65±7.301）分。同時收集SLE患者的詳細臨床資料，包括腎臟損害、關節痛、皮疹、血液系統受累、發熱、雷諾現象等臨床表現。14例健康對照者均為健康志愿者，性別、年齡與SLE患者組匹配，無相關免疫性疾病和近期感染史。所有納入研究的對象根據倫理學要求并簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器 流式細胞術熒光抗體抗人CD4-FITC、抗人IL-17A-PE、同型對照抗體、白細胞刺激合劑（美國BD公司）、固定/透膜劑（美國BD公司）；CD4+T細胞磁珠分選試劑盒、LD細胞分選柱（德國MiltenyiBiotec公司）；人淋巴細胞分離液（北京索來寶公司）；TRIzol試劑（美國 Invitrogen公司）；PrimeScript逆轉錄試劑盒、Real-time PCR試劑盒、PCR引物（日本TaKaRa公司）。Ets-1引物序列的上游引物：5'-GGAGCAGCCAGTCATCTTTC-3'，下游引物：5'-GTCCCGCACATAGTCCTTGA-3'，預計擴增的產物長度為128 bp；β-actin上游引物：5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'，下游引物：5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'，預計擴增的產物長度為186 bp。All-in-One miRNA qPCR引物、逆轉錄試劑盒及PCR試劑盒（美國GeneCopoeia公司）；ABI 7500實時定量PCR儀（美國ABI公司）；BD FACSCantoⅡ流式細胞儀（美國BD公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 流式細胞術 抽取空腹外周靜脈肝素鈉抗凝血20 ml，分選出PBMCs并行細胞計數。取1× 106個細胞，用1 ml含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液重懸，加入2 μl白細胞刺激合劑，置于37℃、5%CO2培養箱5 h后，取出用PBS重懸，1 500 r/min離心10 min，棄上清液，用PBS 50 μl重懸，加入10 μl抗CD4-FITC抗體，避光4℃孵育30 min，3 ml PBS重懸后1 500 r/min離心10 min，棄上清液，加入250 μl固定/透膜劑，避光室溫孵育20 min，用1 ml現配的Wash液重懸離心棄上清液重復2遍，加入50 μl Wash液及抗IL-17A-PE抗體，避光4℃孵育30 min，1 ml Wash液重懸離心棄上清液重復2遍，100 μl PBS重懸，同時染同型對照，24 h內上機檢測。

1.3.2 磁珠分選CD4+T細胞 每107個細胞加入90 μl磁珠分選緩沖液10 μl CD4+T細胞生物素抗體合劑混勻，孵育10 min，每107個細胞再加入20 μl抗生物素抗體磁珠，孵育15 min；每107個細胞加入2 ml緩沖液，1 500 r/min離心10 min后棄上清液；每108個細胞加入500 μl緩沖液重懸細胞，將細胞懸液垂直加入已潤洗過的LD柱中，陰選出CD4+T細胞。

1.3.3 RNA提取和cDNA的合成 取分離好的CD4+T細胞，加入500 μl TRIzol，充分混勻后先后加入三氯甲烷、異丙醇、75%乙醇溶液，最后加入10 μl DEPC水溶解RNA。取2 μl用于RNA濃度和純度測定，計算逆轉所需的RNA體積。利用Prime-Script和All-in-One miRNA逆轉錄試劑盒分別得到相應的cDNA。Ets-1 mRNA逆轉錄條件：37℃、15 min，85℃ 5 s。miRNAs逆轉錄條件：37℃ 60 min，85℃ 5 min，隨后將miRNAs逆轉錄產物稀釋5倍。根據SYBR Green PCR和All-in-One miRNA qPCR試劑盒的檢測條件，分別擴增Ets-1、miR326及內參基因獲得ΔCT值，選擇對照組一樣本ΔCT值為基準計算ΔΔCT，以2-ΔΔCT值作為各樣本相對表達量。1.3.4 實驗室指標檢測 抗核抗體使用間接免疫熒光法檢測，Western blot法檢測抗核抗體譜；免疫球蛋白IgG、IgM、IgA及補體C3、C4用免疫比濁法檢測，常規檢測血、尿常規、血沉（erythrocyte sedimentation rate，ESR）。

1.4 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行分析，符合正態分布的計量資料采用t檢驗，以表示。三組之間的比較使用單因素方差分析及q檢驗；不符合正態分布的計量資料采用非參秩和檢驗，以中位數（25分位數，75分位數）［M（P25，P75）］表示，三組間比較使用Kruskal-Willis秩和檢驗，如差異有統計學意義則進行兩兩比較，α'修正為0.05/3。雙變量符合正態分布的使用Pearson分析相關性，余采用Spearman分析相關性。制圖采用 Prism 5.0 （GraphPad）軟件。

2 結果

2.1 miR326和Ets-1在CD4+T細胞中的表達水平 SLE組CD4+T細胞中miR326的相對表達量明顯高于對照組，差異有統計學意義。采用Kruskal-Willis秩和檢驗比較三組間差異有統計學意義（χ2= 22.785，P=0.000），進行兩兩比較，α'修正為0.05/ 3?；顒咏M與對照組比較，差異有統計學意義。活動組與穩定組差異有統計學意義，穩定組與對照組比較，CD4+T細胞中miR326的表達有增高趨勢，但差異無統計學意義。

與對照組比較，Ets-1的相對表達量在SLE組明顯減低，差異有統計學意義。Kruskal-Willis秩和檢驗三組間差異有統計學意義（χ2=19.956，P= 0.000），進行兩兩比較，α'修正為0.05/3。活動組明顯低于對照組和穩定組；穩定組與對照組比較，差異無統計學意義。見表1。

2.2 miR326與Ets-1表達及Th17細胞比例的相關分析 SLE組患者外周血中，Th17（CD4+IL-17A+）/CD4+T細胞比例（0.642±0.270）%明顯高于對照組（0.407±0.225）%。使用單因素方差分析檢驗三組，差異有統計學意義（F=16.086，P= 0.000），使用q檢驗進行兩兩比較。其中活動組（0.793±0.191）%顯著高于對照組和穩定組（0.475 ±0.248）%，差異有統計學意義。穩定組與對照組比較，差異無統計學意義（P=0.367）。分析miR326 與Ets-1、miR326與Th17細胞比例的相關性，結果顯示，miR326與Ets-1呈負相關性（r=-0.667，P＜0.001）（圖1A）；miR326與Th17細胞比例呈正相關性（r=0.525，P=0.001）（圖1B）；Ets-1的相對表達量與Th17細胞的比例呈負相關性（r=-0.465，P =0.003）（圖1C）。

表1 SLE患者CD4+T細胞中miR326與Ets-1相對表達量的比較

圖1 miR326、Ets-1 mRNA相對表達量及Th17細胞比例之間相關性分析

2.3 SLE患者miR326、Ets-1 mRNA的表達水平及Th17比例與臨床特征的分析 將有無關節痛、腎臟受累、皮疹、發熱、血液系統受累、雷諾現象等臨床表現的SLE患者分為陽性組與陰性組，分別比較兩組miR326、Ets-1 mRNA的表達量以及Th17細胞比例有無差異。結果顯示，在SLE患者腎臟受累、皮疹、發熱及血液系統受累患者中，miR326表達水平增高，Ets-1 mRNA表達水平降低，Th17細胞比例也增高。有無關節痛及雷諾現象組間比較差異無統計學意義。分析SLE患者miR326表達水平與SLEDAI的相關性，結果顯示兩者呈正相關性（r= 0.531，P＜0.001），Ets-1表達水平與SLEDAI評分呈負相關性（r=-0.536，P＜0.001），Th17/CD4+T細胞比例與 SLEDAI評分呈正相關性（r=0.514，P＜0.001）。見表2。

2.4 SLE患者miR326、Ets-1 mRNA的表達水平及Th17細胞比例與實驗室指標的相關分析 結果顯示miR326表達水平與抗dsDNA抗體、抗Sm抗體、抗RNP抗體、抗核小體抗體、IgG、ESR等指標呈正相關性，與C3、C4呈負相關性；Ets-1 mRNA的表達與抗dsDNA抗體、抗Sm抗體、抗RNP抗體、抗核小體抗體呈負相關性，與白細胞、C3、C4呈正相關性；Th17細胞與抗dsDNA、抗RNP、抗核小體抗體呈正相關性，與白細胞、C3、C4呈負相關性。結果顯示，SLE活動性指標如抗dsDNA、抗核小體抗體、C3、C4等與miRNA326、Ets-1的表達以及Th17比例明顯相關（表3）。與淋巴細胞、血小板、抗核糖體P抗體、Ig、CRP等指標無相關性（P＞0.05）。

表2 SLE患者miR326、Ets-1 mRNA的表達水平及Th17細胞比例與臨床特征的比較

3 討論

microRNA通過與mRNAs結合，在后轉錄水平調控基因表達。目前發現microRNA參與多種自身免疫疾病的發生。本課題組前期利用生物信息學方法篩選出以Ets-1為靶基因的miRNAs中包括miR326［4］。研究［5］顯示多種 microRNA參與調節IL-17細胞因子及其受體的表達。一項系統性硬化癥的研究［6］顯示miR326能夠抑制Ets-1的轉錄，并且其表達增加與Th17細胞分化增多及疾病活動密切相關，提示miR326可能通過調控Ets-1的表達，影響Th17細胞分化，參與自身免疫炎癥反應。本研究僅進行了簡單的相關性分析，結果提示miR326與疾病活動相關，但miR326的表達是否受藥物如糖皮質激素、免疫抑制劑的影響目前尚不清楚，需要進一步研究。

表3SLE患者miR326、Ets-1 mRNA表達水平及Th17細胞比例與實驗室指標的相關性分析

Ets-1是轉錄因子 Ets家族成員之一，近年的GWAS研究［7］顯示 Ets-1是亞洲人SLE的易感基因，并且Ets-1的基因多態性與SLE臨床表型有關。既往已有研究［8］表明，SLE患者的PBMCs中Ets-1 mRNA表達水平降低，但尚不清楚SLE患者不同細胞亞群中Ets-1的表達是否存在差異。本研究針對性地檢查SLE患者CD4+T細胞亞群中Ets-1 mRNA的表達量，結果進一步證實了SLE患者在特定的T細胞亞群中存在Ets-1的表達缺陷，從而降低了對Th17細胞等免疫炎性細胞的負向調控，導致炎癥細胞大量增殖。除了miR326，還有其他microRNA如miR155、miR221、miR222參與 Ets-1的調控，這些microRNA是否與miR326有協同作用，是否也通過調控Ets-1的表達參與SLE的發病都值得進一步探索。

大量的研究［9-10］顯示血清中IL-17A的水平及Th17細胞數量與SLE疾病活動有關。并且新發狼瘡患者外周血中Th17細胞比例與SLEDAI評分、血清中C3水平和抗dsDNA抗體的水平相關。根據miR326靶向抑制Ets-1的轉錄，Ets-1缺陷導致Th17細胞分化增多，推測miR326可能通過抑制Ets-1的表達調節Th17細胞分化參與SLE疾病活動。本項研究結果支持上述推測，提示miR326可能通過抑制Ets-1 mRNA的表達水平導致Th17細胞的過度增殖，促進了免疫炎癥過程，使SLE疾病活動加劇。本研究僅檢測了Ets-1 mRNA的水平，需要進一步進行Western blot實驗，從蛋白水平進一步驗證。下一步可以通過離體實驗、動物實驗等選擇性的抑制或者促進miR326的表達，再檢測Ets-1的表達水平，進一步驗證本實驗。

綜上所述，miR326、Ets-1及Th17細胞在SLE患者CD4+T細胞中表達異常，并且與腎臟受累、皮疹、發熱、血液系統受累等以及抗dsDNA抗體滴度增高、補體降低有關，提示在SLE的疾病活動中發揮重要作用。miR326可能通過抑制Ets-1的表達，促進Th17細胞的分化，參與SLE的發病，并可能與臨床表型相關。進一步研究miR326與Ets-1是否通過其他可能的作用機制，調節Th17及Treg這兩組極性細胞的分化與功能，有助于揭示SLE患者免疫紊亂的具體環節，為臨床免疫干預提供新的治療靶點。

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miR326 participates in SLE morbidity by regulating Ets-1 expression and Th17 cells differentiation

Dai Chao，Tao Jinhui，Sun Xiaoge，et al
（Dept of Rheumatism，Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

Objective To detect the expression of miR326 and Ets-1 in CD4+T cells and the ratio of Th17 cells of patients with systemic lupus erythematosus（SLE），to analyze their relationship with each other and with the clinical data，to explore the potential pathogenesis of SLE.Methods 40 patients according to 2009 American College of Rheumatology（ACR）SLE diagnosis standards were selected，and recorded their clinical data.14 healthy adults without autoimmune disease were chosen as controls.Flow cytometry was used to inspect the ratio of Th17 cells （CD4+IL-17A+）/CD4+T cells.Magnetic activated cell sorting was used to enrich the CD4+T cells，and reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）was used to inspect the relative expression of miR326 and Ets-1 mRNA in CD4+T cells.Results Compared to the healthy controls，the miR326 expression level in the CD4+T cells of SLE patients was increased obviously（P=0.003），and the expression level was higher in the active group than that in remitting group（P=0.000）.The Ets-1 mRNA expression level in CD4+T cells of SLE group was reduced obviously than that in the controls（P=0.002），and the expression in the active group was lower than that in remitting group（P=0.001）.Compared to the controls，the ratio of Th17 cells/CD4+T cells in SLE group was increased obviously（P=0.004），and significant difference was found between the active group and the remitting group.The miR326 expression had a negative correlation with the Ets-1 expression（P＜0.001）and a positive correlation with the ratio of Th17 cells（P=0.001）.There was also a negative correlation between Ets-1 expression and the ratio of Th17 cells（P=0.003）.The miR326 expression and the ratio of Th17 cells both had a positive correlation with the SLEDAI score，while the Ets-1 expression had a negative correlation with the SLEDAI score.In SLE patients who suffered from erythra，hematologic system or kidney impairment，the miR326 expression and the ratio of Th17 cells increased significantly，while the Ets-1 expression induced compared to the rest SLE patients. The miR326 expression and the ratio of Th17 cells positively regulated with anti-dsDNA antibodies level and antinucleosome antibodies level，and negatively regulated with C3 and C4.On the contrary the Ets-1 expression had a negative regulation with anti-dsDNA antibodies and anti-nucleosome antibodies and a positive regulation with C3 and C4.Conclusion The miR326 expression of CD4+T cells increases obviously in SLE patients and positively correlates to the ratio of Th17 cells and the disease activity index，but has a negative correlation with Ets-1 expression.The results prompt that miR326 could participate in the disease activity of SLE through inhibiting the Ets-1 gene expression and promoting the differentiation of Th17 cells.

systemic lupus erythematosus；miRNAs；Ets-1；Th17 cells

R 593.24.02；R 593.241.02

A

1000-1492（2016）09-1320-05

時間：2016-8-1 14：07

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160801.1407.038.html

2016-05-04接收

國家自然科學基金（編號：81373186）

安徽醫科大學附屬省立醫院風濕免疫科，合肥 230001

戴 超，女，碩士研究生； 李向培，女，教授，主任醫師，博士生導師，責任作者，E-mail：lixiangpei55@126.com