基于iTRAQ定量蛋白質組學方法篩選鼻咽癌放射抗拒相關蛋白

高 勁，錢立庭，陶振超，蒲友光，周 燕，楊麗萍，何 健，楊 婧，黃一凡

基于iTRAQ定量蛋白質組學方法篩選鼻咽癌放射抗拒相關蛋白

高 勁1，錢立庭1，陶振超1，蒲友光2，周 燕1，楊麗萍1，何 健1，楊 婧1，黃一凡1

目的 比較不同放射敏感性鼻咽癌患者血清蛋白質表達差異，篩選出與鼻咽癌放射抗拒性相關的蛋白質。方法提取不同放射敏感性鼻咽癌患者血清蛋白，應用核素標記相對和絕對定量（iTRAQ）技術標記蛋白，聯合液相色譜和串聯質譜（LC-MS/MS）分離、分析肽段。采用Proteome Discoverer 1.4軟件對蛋白進行鑒定和定量分析，對獲得的差異蛋白進行GO分析。結果 共鑒定出差異表達的蛋白質65個，其中上調34個、下調31個，GO分析顯示差異表達的蛋白質主要涉及生物學過程調控、壓力應激反應及分解代謝等生物學過程。結論 S100A7、胰島素樣生長因子結合蛋白2、α1抗胰蛋白酶和熱休克蛋白等差異表達的蛋白質可能與鼻咽癌放射抗拒性相關。

鼻咽癌；輻射抗拒；蛋白質組學

鼻咽癌是我國常見惡性腫瘤之一，其主要治療方法為放射治療，輔助以化療及手術等綜合治療。早期是以單純放射治療為主，而中晚期是以放化綜合治療為主要治療手段。盡管放射治療已取得較好的療效，然而放射抗拒所致的局部失敗和遠處轉移仍較常見［1］。腫瘤細胞放射敏感性差異是導致局部復發率及殘留率高的一個重要原因。研究［2］表明當人體主要攜氧工具-血紅蛋白濃度下降時，血氧含量減少，鼻咽癌患者表現為放射抗拒，局部控制率明顯降低。準確地評估腫瘤放射敏感性是實行個體化方案治療至關重要的一步，也是臨床亟待解決的問題。該研究采用同位素相對標記與絕對定量標記技術（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）與二維液相色譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）聯用質譜分離鑒定技術，分析尋找與放射抗拒相關的蛋白，從而為個體化治療奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病例資料 收集2013年8月～2015年7月于安徽醫科大學附屬省立醫院病理確診的鼻咽癌患者血清樣本40例。清晨6點空腹取靜脈血5 ml于促凝管內，室溫放置2 h，4℃恒溫離心機2 500 r/min離心20 min，置于-80℃冰箱分裝保存。鼻咽部照射40 Gy時MRI檢查結果作為放射敏感性的評價指標，根據WHO實體瘤客觀療效評價標準，腫瘤消退＜50%定義為放射抗拒，＞50%定義為放射敏感，分為放射敏感組與放射抵抗組［3］。每組選取標本20例，兩組患者性別、年齡、分期等臨床病理因素差異無統計學意義。

1.2 去除高豐度蛋白 各組的20例樣本以等體積混合，采用去血清高豐度親和色譜柱Agilent Multiple Affinity Removal LC Column-Human 14去除高豐度蛋白質，得到低豐度組分溶液。應用10 ku超濾管進行超濾濃縮，加入一倍體積的SDT裂解液，沸水浴15 min，13 400 r/min離心20 min，取上清液。采用BCA法進行蛋白質定量。分裝樣品，-80℃保存。

1.3 SDS-PAGE電泳 各樣品取蛋白質20 μg分別加入5×上樣緩沖液，沸水浴5 min，進行12.5% SDS-PAGE電泳（恒流14 mA、90 min），考馬斯亮藍染色。

1.4 FASP酶解 各樣品取30 μl蛋白質溶液，分別加入DTT至終濃度為100 mmol/L，沸水浴5 min，冷卻至室溫。加入200 μl UA buffer混勻，轉入10 ku超濾離心管中，13 400 r/min離心15 min，棄濾液；加入 100 μl IAA buffer（100 mmol/L IAA in UA），600 r/min振蕩1 min，室溫避光反應30 min，13 400 r/min離心15 min；加入100 μl UA buffer，13 400 r/min離心15 min；加入100 μl 10倍稀釋的Dissolution buffer，13 400 r/min離心15 min；加入40 μl Trypsin buffer（4 μg Trypsin in 40 μl Dissolution buffer），600 r/min振蕩1 min，37℃放置16～18 h；換新收集管，13 400 r/min離心15 min；再加入40 μl 10倍稀釋的Dissolution buffer，13 400 r/min離心15 min，收集濾液。采用C18Cartridge對肽段進行脫鹽，肽段凍干后加入40 μl Dissolution buffer復溶，肽段定量（OD280）。

1.5 iTRAQ試劑標記 兩組樣本各取100 μg用于iTRAQ試劑標記，放射敏感組和抗拒組分別標記以113和116試劑，具體步驟參照美國AB公司iTRAQ試劑盒說明書進行，進行3次技術重復。

1.6 強陽離子交換色譜（strong cation exchange，SCX）分級 將每組標記后的肽段混合，采用AKTA Purifier 100進行分級。緩沖液A液為10 mmol/L KH2PO4，25%ACN，pH 3.0；B液為 10 mmol/L KH2PO4，500 mmol/L KCl，25%ACN，pH 3.0。色譜柱以A液平衡，樣品由進樣器上樣到色譜柱進行分離，流速為1 ml/min。

1.7 質譜鑒定 每份樣品采用納升流速的HPLC液相系統Easy nLC進行分離。緩沖液A液為0.1%甲酸水溶液，B液為0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈為84%）。樣品經色譜分離后用Q-Exactive質譜儀進行質譜分析。檢測方式為正離子，母離子掃描范圍300～1 800 m/z。

1.8 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行分析。質譜數據采用Mascot 2.2和Proteome Discoverer 1.4進行數據庫搜索，數據庫為uniprot_human。符合表達差異倍數大于1.2倍（上下調）且P＜0.05篩選標準的蛋白質視為差異表達蛋白質。鑒定得到的差異蛋白通過生物信息學方法使用GO注釋及富集分析，分別從生物學進程（biological process，BP）、細胞成分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）這3方面進行基因顯著性分析。通過Fisher精確檢驗來評價某個GO term蛋白質富集度的顯著性水平。

2 結果

2.1 差異表達蛋白質的篩選 質譜共得到3 780個唯一多肽片段，經數據庫分析后，共獲得457個蛋白，其中有65個差異表達的蛋白質，其中，放射抗拒組相對于放射敏感組上調差異表達蛋白質34個（表1），下調差異表達蛋白質31個（表2）。

2.2 差異表達蛋白質GO基因功能分類 對篩選的65個差異表達蛋白質進行GO功能注釋，在生物學進程分析結果中，差異表達蛋白質主要參與包括生物學過程調控、壓力應激反應、分解代謝等主要進程。其中12%的蛋白質參與生物學過程調控，S100A7參與生物學過程調控；壓力應激反應的蛋白質占12.0%，補體因子H相關蛋白、熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）和胰島素樣生長因子結合蛋白-2（insulin-like growth factor binding protein-2，IGFBP2）都參與了壓力應激反應；與分解代謝有關的蛋白質占11%，α1抗胰蛋白酶處于這一進程中；其他的蛋白質與信號傳導、生物學的黏附和免疫應答過程有關。在亞細胞定位分析中，分布在細胞器和胞外的蛋白質各占24%，其他還有一些蛋白質屬于細胞膜、胞外區和細胞連接的成分。在分子功能分析中，其中結合蛋白質占51%，差異表達蛋白有催化活性、酶調節活性和轉運活性。

表1 上調部分差異表達的蛋白質

3 討論

鼻咽癌的放射敏感性是影響療效的重要因素。如果在放療前能夠對個體腫瘤的放射敏感性進行預測，可有助于選擇合適的個體化治療方案，提高腫瘤控制率，減少正常組織放射損傷。目前，相關研究［4］已證實放射敏感和放射抗拒的鼻咽癌細胞株，其蛋白質表達存在差異，部分蛋白表達上調或下調。然而，其僅僅為細胞實驗，并不能完全反映人體狀況，更難以在臨床使用。而血清標本的優勢明顯，有標本易于采集和所需的標本量較少等優點，便于臨床使用。

高通量蛋白質組學技術為本研究腫瘤放射敏感性提供了新的手段，蛋白質的結構和功能最終影響著生命活動的變化，尋找與放射抗拒相關的蛋白用于個體化方案制定具有重要意義，不僅有較高的臨床應用價值，而且對揭示放療抗拒機制意義重大。

本研究利用iTRAQ技術篩選放射敏感和放射抗拒差異蛋白，放射抗拒組相對于放射敏感組上調差異表達蛋白質34個，下調差異表達蛋白質31個。初步鑒定出的有明確功能的蛋白分別涉及到幾種不同的生物過程：生物學過程調控、壓力應激反應、分解代謝等主要進程。

S100A7是S100蛋白質家族成員，可調節細胞的增殖、凋亡、信號轉導等，是頭頸部腫瘤的不良預后指標［5］?？赏ㄟ^晚期糖基化終末產物（receptor for advanced glycation end products，RAGE）介導的內分泌機制在腫瘤局部招募基質金屬蛋白9、環氧化酶2等促炎癥因子表達，促進腫瘤血管再生及腫瘤增殖［6］。研究［7］顯示在乳腺癌細胞中，S100A7可促進核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）DNA結合活性和基質金屬蛋白9和血管內皮生長因子表達，從而促進腫瘤細胞增殖和侵襲。而NF-κB參與放射治療抗拒的相關通路，活化可導致腫瘤細胞對放射治療的抵抗［8］。這可能是S100A7導致放療抗拒的原因。

表2 下調部分差異表達的蛋白質

IGFBP2在多種腫瘤中明顯升高，與腫瘤侵襲相關，影響患者預后［9-10］。Guo et al［11］發現在肺癌患者血清中IGFBP2明顯升高，且與腫瘤大小分期明顯相關，血清濃度升高患者生存時間縮短。Uzoh et al［12］發現IGFBP2促進前列腺癌細胞生長，而且增加化療抗拒，抑制表達可增加化療敏感性。

α1抗胰蛋白酶濃度在炎癥、感染和腫瘤時會明顯增加，研究［13］顯示在肺癌和前列腺癌中均升高，隨著分期增加而明顯升高。

HSP是機體存應激條件下合成的應激蛋白質，參與調節細胞的增殖、分化和細胞抗凋亡的信號轉導，與放射抗拒性相關。Du et al［14］發現對放射抗拒的子宮內膜癌細胞采用沉默HSP70后，細胞的凋亡率明顯增加，抑制HSP70表達可明顯增加放射治療效果。王潤文等［15］發現放療后有殘留鼻咽癌患者HSP70陽性表達率明顯高于病灶完全消失患者，兩組相比差異有統計學意義。作者認為HSP70是影響鼻咽癌放射抗拒的重要因素。

本實驗結果提示，iTRAQ技術是鼻咽癌放射敏感性研究科學可靠的預測方法，可以精確地篩選出腫瘤輻射抗拒的相關蛋白。然而，由于腫瘤的放射抗拒機制復雜，涉及到多種復雜因素相互作用，其分子機制仍不清楚。本研究尚處于初級階段，篩選出蛋白質在放射抗拒中的具體機制仍不明確，還需要進一步研究。

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Screening of radioresistant associated proteins in nasopharyngeal carcinoma by iTRAQ quantitative proteomics

Gao Jin，Qian Liting，Tao Zhenchao，et al
（Dept of Radiation Oncology，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei230001）

Objective To discover the proteins related to nasopharyngeal carcinoma（NPC）radioresistance by screening differentially expressed proteins in NPC patients with different radiosensitivity.Methods Two groups of sera were respectively collected from NPC patients with different radiosensitivity（20 casesineach group）.Isobaric tags for relative and absolute quantitation（iTRAQ）-taggingcombined with liquid chromatography tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）analysis was used to identification of differentially expressed proteins between the two groups.The identification and quantitation of the proteins were analyzed by Proteome Discoverer 1.4 software.The proteins differentially expressed were analyzed by GO（Gene Ontology）terms.Results A total of 65 differentially expressed proteins were identified，of which 34 were up-regulated and 31 were down-regulated.GO analysis showed these proteins to be involved in keybiological processes such as biological regulation，response to pressure stress and catabolism.Conclusion Analysis identify the following 4 proteins that may be the candidate biomarkers for predicting radioresistance of NPC：S100A7，insulin-like growth factor-binding protein 2，alpha-1-antitrypsin and HSP 70.

nasopharyngeal carcinoma；radioresistance；proteomics

R 739.63

A

1000-1492（2016）09-1333-05

時間：2016-8-1 14：07

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160801.1407.044.html

2016-06-02接收

安徽省自然科學基金（編號：1408085MH189）；安徽省衛生廳醫學科研課題（編號：13ZC009）

安徽醫科大學附屬省立醫院1放療科、2腫瘤表觀研究室，合肥 230001

高 勁，男，副教授，副主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：gj11667@126.com