筋骨草總黃酮抗小鼠肝纖維化的作用機制

應雄，賴文芳，許力偉，宋百穎，蘇燕青，南麗紅

（福建中醫藥大學藥學院，福建福州350122）

筋骨草總黃酮抗小鼠肝纖維化的作用機制

應雄，賴文芳，許力偉，宋百穎，蘇燕青，南麗紅

（福建中醫藥大學藥學院，福建福州350122）

目的研究筋骨草總黃酮抗小鼠肝纖維化的作用機制。方法健康成年雄性昆明種小鼠60只，隨機分為正常對照組、模型對照組、筋骨草總黃酮0.54 g／kg組（低劑量組）、筋骨草總黃酮1.08 g／kg組（中劑量組）、筋骨草總黃酮2.16 g／kg組（高劑量組），20%CCl4橄欖油溶液小鼠背部皮下注射，制作小鼠肝纖維化模型，Elisa法檢測HA、PCⅢ、Ⅳ型膠原、LN的濃度，W estern Blot檢測MMP-13、TIMP-1、SDF-1α、CXCR 4、GRP78、CRT蛋白表達水平。結果與模型對照組比較，筋骨草總黃酮3個劑量組能明顯降低HA、PCⅢ、Ⅳ型膠原、LN含量，促進MMP-13的蛋白表達，抑制TIMP-1、SDF-1α、CXCR 4、GRP78、CRT蛋白表達，差異具有統計學意義（P＜0.05）。結論筋骨草總黃酮抗小鼠肝纖維化的機制是促進MMP-13，抑制TIMP-1、SDF-1、CXCR 4、內質網應激分子表達蛋白表達，使ECM沉積減少，抑制肝纖維化發生。

筋骨草總黃酮；肝纖維化；細胞外基質；基質金屬蛋白酶；內質網應激

肝纖維化是肝臟對各種原因所致肝損傷的修復反應，其特征表現為肝內細胞外基質（extracellularmatric，ECM）過度合成、沉積，是慢性肝病發展為肝硬化的中間過程，也是發生肝癌的危險因素之一，是各種慢性肝病的共同病理過程。肝纖維化伴隨著肝臟形態學和生物化學的改變，導致肝臟結構和代謝的異常［1］。肝星狀細胞（haptic stellate cel1，HSC）是肝臟病理情況下ECM沉積的主要細胞來源，在纖維化發生、發展及轉變中，處于中心細胞環節的地位。在肝臟病理情況下，HSC可分泌Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、Ⅳ型膠原、層黏蛋白（LN）、透明質酸（HA）等多種ECM成分，用以修補壞死脫落的肝組織缺損空間。基質細胞衍生因子（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）屬于趨化因子CXC亞家族成員，CXCR4為其受體。研究發現，肝組織卵圓細胞增殖及外周血干細胞可促進肝組織再生，SDF-1和CXCR4基因在體內動員和活化中起到重要作用［2］。內質網應激（（endoplasmicreticulum stress，ERS）與慢性肝損傷尤其是肝纖維化的發生、發展具有相關性，鈣網蛋白（calreticulin，CRT）與GRP78作為內質網分子伴侶蛋白［3］，目前對SDF-1、CXCR4、CRT與GRP78在肝纖維化肝組織中的研究尚少。

筋骨草為唇形科植物金瘡小草（Ajuga Decumbens Thunb）的全草，性味苦寒，具有燥濕解毒、清熱瀉火、養筋活血的功效，對多種細菌具有抑制作用，其主要有效部位為黃酮類、研究表明筋骨草黃酮類具有改善肝細胞功能的保肝作用［4］。本研究通過檢測ECM主要成分HA、PCⅢ、Col-Ⅳ和LN的含量，研究筋骨草總黃酮對小鼠肝纖維化的作用機制。

1　實驗材料

1.1動物選取健康昆明種小鼠60只，雌雄各半，SPF級，體質量20～25 g，動物許可證號：SCXK（閩）2012-0001，福建中醫藥大學實驗動物中心飼養。

1.2試劑筋骨草總黃酮（福建中醫藥大學藥學院藥學實驗室，總黃酮含量為18.14%）；MMP-13多克隆抗體（批號：sc-30073）、TIMP-13多克隆抗體（批號：sc-21734）、SDF-1α多克隆抗體（批號：sc-28876）、CXCR4多克隆抗體（批號：sc-9046）、GRP78多克隆抗體（批號：sc-376768）、CRT多克隆抗體（美國santa cruz公司，批號：sc-8861）；β-actin（碧云天生物技術研究所，批號：H015）；HA（北京博奧森生物公司，批號：ER-1398）；PCⅢElisa試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：H212）；Ⅳ型膠原Elisa試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：H145）；LN Elisa試劑盒（上海信裕生物科技有限公司，批號：SEA082Mu）。

1.3實驗儀器凝膠成像分析系統（美國Bio-rad公司）、高速臺式冷凍離心機（美國Thermo Fisher公司）。

2　實驗方法

2.1模型的制備用CC145 m L／kg在小鼠背部皮下注射，后用20%CCl4橄欖油溶液5 m L／kg在背部皮下注射，3 d 1次，實驗期間小鼠自由飲水和進食。

2.2實驗分組與處理昆明種小鼠60只，適應喂養1周后隨機分為正常對照組、模型對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，于造模第4周，5組小鼠灌胃給藥，按30 mL／kg分別給予生理鹽水和筋骨草總黃酮。低劑量組、中劑量組、高劑量組分別給予筋骨草總黃酮0.54 g／kg、1.08 g／kg、2.16 g／kg，每日1次，連續4周。末次給藥2 h后，摘眼球取血，取肝組織凍存于液氮，備用。

2.3Elisa測定按試劑盒說明書檢測血清HA、PCⅢ、Col-Ⅳ、LN相對含量。

2.4Western blot檢測大鼠肝組織MMP-13、TIMP-1、SDF-1α、CXCR4、GRP78、CRT的蛋白表達提取總蛋白，用SDS-PAGE垂直板全濕法電泳，總蛋白經SDS-PAGE分離后，將凝膠中的蛋白轉移至PVDF膜，用封閉液封閉2 h后，加入稀釋的一抗（MMP-13抗體1∶500、TIMP-1抗體1∶800、SDF-1α抗體1∶800、CXCR4抗體1∶800、GRP78抗體1∶300、CRT抗體1∶500、β-actin單克隆抗體1∶3 000，4℃下孵育過夜，次日TBS洗3遍，每次10 min，加入1∶1000稀釋HRP標記二抗，室溫下孵育2 h后TBS洗膜。加ECL試劑，經凝膠成像分析系統檢測，分析目標條帶的灰度值，計算3個給藥組與空白對照組灰度值的比值，并統計各組之間的差異。

2.5統計學處理數據用x±s表示，用SPSS 20.0統計軟件進行統計學處理，組間比較用t檢驗和單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

3　結果

3.1筋骨草總黃酮對肝纖維化小鼠血清HA、PCⅢ、Ⅳ型膠原、LN含量的影響見表1。

3.2TFA對肝纖維化小鼠MMP-13和TIMP-1蛋白表達的影響見圖1、表2。

3.3TFA對肝纖維化小鼠SDF-1α和CXCR4蛋白表達的影響見圖2、表3。

3.4TFA對肝纖維化小鼠GRP78和CRT蛋白表達的影響見圖3、表4。

表2　筋骨草總黃酮對MMP-13、TIMP-1蛋白表達的影響（x±s）

4　討論

4.1HA、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、LN是ECM的主要成分，病理狀態下HA、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ的表達為靜止時的60～70倍。經TFA作用后，HA、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、LN含量顯著降低。基質金屬蛋白酶MMP-13是降解ECM的主要間質膠原酶，MMP-13主要受TIMP-1調控。我們發現經TFA不同濃度作用后，MMP-13蛋白表達明顯上調，TIMP-1蛋白明顯下調，結果表明筋骨草總黃酮可通過促進MMP-13、抑制TIMP-1蛋白表達，促進HA、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、LN含量降解，抑制細胞外基質積聚。

表3　筋骨草總黃酮對SDF-1α和CXCR4蛋白表達的影響（x±s）

表4　筋骨草總黃酮對GRP78和CRT蛋白表達的影響（x±s）

4.2SDF-1有2個亞型：SDF-1α和SDF-1β，它們是由同一基因編碼的2種不同的拼接變異體，二者在表達及功能上無明顯區別。人與小鼠的SDF-1有99%同源性，且CXCR4為SDF-1唯一受體。本研究發現模型對照組小鼠SDF-1和CXCR4表達升高，這部分是因為肝炎時，膽管上皮細胞及膽小管增生，淋巴細胞浸潤，導致肝炎組織SDF-1和CXCR4表達升高，經不同濃度TFA作用后，SDF-1和CXCR4表達降低。研究表明，在肝細胞損傷時，蛋白質不能在肝細胞內正常折疊而引發內質網應激，在內質網應激反應過程中，會發生一系列細胞因子，如TGF-β等，細胞因子促使肝星狀細胞產生膠原纖維，最終導致纖維化的發生［5］。內質網伴侶蛋白GRP78介導新生蛋白的加工成熟，是細胞蛋白質成熟、維系細胞功能和生命的關鍵性調節蛋白，被認為是內質網應激的標志性蛋白［6］。我們的研究表明在肝纖維化小鼠的肝組織中，GRP78、CRT蛋白表達水平顯著升高，經筋骨草總黃酮不同濃度作用后，能夠降低GRP78、CRT蛋白表達水平。

綜上所述，用20%的CCl4橄欖油溶液建立的小鼠肝纖維化模型中，ECM含量異常增高，MMP-13、TIMP-1、SDF-1、CXCR4、內質網應激分子表達異常，參與了肝纖維化的發生。經TFA不同濃度作用后，能使ECM沉積減少，逆轉相關基因的表達，抑制肝纖維化的發生。

［1］CHUN-HUI LI，LI-HUIPAN，ZONG-WEIYANG.ETPreventive effect of Qianggan-Rongxian Decoction on rat live fibrosis［J］. World Journal of Gastroenterology，2008，14（22）：3569-73.

［2］王慶國，嚴福華，徐鵬舉，等.四氯化碳誘導小鼠肝纖維化模型中SDF-1α／CXCR4的表達及其意義［J］.中國實驗動物學報，2009，17（5）：384-7.

［3］田慧群，吳薇，鄒曉華，等.小鼠肝纖維化中內質網應激分子的表達與作用［J］.生物技術，2015，25（1）：71-4.

［4］賴文芳，陳燕，賈銣，等.筋骨草總黃酮對小鼠肝纖維化的影響［J］.福建中醫藥大學學報，2012，22（5）：46-47.

［5］TANJORE H，LAWSON W E，BLACKWELL T S.Endoplasmic reticulum stress as a pro-fibrotic stimulus［J］.Biochim Biophys Acta，2013，1832（7）：940-7.

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R285.5

B

1000-338X（2016）05-0013-03

2016-05-10

國家自然科學基金資助課題（81473382），福建省自然科學基金資助課題（2015J01328），福建中醫藥大學科技項目資助課題（X2013010）

應雄（1992—），男，2014級藥理學專業碩士研究生，主要從事藥理學研究。

南麗紅（1985—），女，副教授。E-mail：13559102126@163. com