Folin-Ciocaheu比色法測定白花蛇舌草總酚的含量

林珊，陳達鑫，蔡巧燕，彭軍，林久茂

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建福州350122；2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建福州350122）

Folin-Ciocaheu比色法測定白花蛇舌草總酚的含量

林珊1，2，陳達鑫1，2，蔡巧燕1，2，彭軍1，2，林久茂1，2

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建福州350122；2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建福州350122）

目的測定白花蛇舌草中總酚的含量。方法用Folin-Ciocaheu比色法，以沒食子酸為對照品，測定白花蛇舌草中總酚的含量。結果沒食子酸在0.82～5.74μg／m L線性關系良好，白花蛇舌草總酚含量為111.27 mg／g。結論Folin-Ciocaheu比色法簡單、快速、穩定、可行，可為白花蛇舌草的質量控制提供了實驗依據。

白花蛇舌草；總酚；含量測定；Folin-Ciocaheu比色法

白花蛇舌草Hedyotis Diffusa Willd為茜草科草本植物，具有清熱解毒、利尿消腫、活血止痛、抗菌消炎、抗腫瘤的功效，臨床治療惡性腫瘤、胃腸炎、闌尾炎、泌尿系感染等［1］。抗腫瘤活性為白花蛇舌草最重要的藥理活性，中醫一直用于腹部腫瘤治療和癌癥放療、化療后的輔助治療，效果明顯。我們課題組在藥理研究中發現，白花蛇舌草的抗腫瘤作用確切［2-4］。白花蛇舌草主要化學成分有萜類、黃酮類、蒽醌類、香豆素類和酚酸類等化合物，總酚是一類廣泛存在于植物體內的多羥基酚類化合物的總稱，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等作用［5］。為了開發利用白花蛇舌草中酚類化合物，我們用Folin-Ciocaheu比色法測定白花蛇舌草中總酚的含量，為白花蛇舌草的質量控制提供實驗依據。

1　材料

1.1藥材白花蛇舌草購自福建中醫藥大學國醫堂，產自河南，經福建中醫藥大學藥學院范世明高級實驗師鑒定為茜草科植物白花蛇舌草。

1.2試劑沒食子酸對照品（成都曼斯特生物科技有限公司，純度≥98%）；福林酚試劑（北京索萊寶科技有限公司）；其它試劑為分析純。

1.3儀器UV-1800紫外可見分光光度計（日本島津公司）；SHB-Ш循環水式多用真空泵、RZ01C旋轉蒸發器、HH-S恒溫水浴鍋（鄭州市長城科技工貿有限公司）；SFG-02B電熱恒溫鼓風干燥箱（黃石市恒豐醫療器械有限公司）；KQ-500E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AR2130電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；CP225D電子天平（德國賽多利斯公司）；Elix5純水制備系統（廈門市精藝興業科技有限公司）。

2　方法與結果

2.1對照品溶液的制備稱取經105℃干燥至恒重的沒食子酸對照品4.1 mg，置25 mL瓶中，60%乙醇溶解并定容至刻度，配制成0.164 mg／mL對照品溶液，備用。

2.2供試品溶液的制備稱取60℃恒溫干燥的白花蛇舌草細粉1.5 g，加10倍量的85%乙醇，回流提取2次，每次1 h，過濾，合并過濾液，定容至25 mL瓶中，備用。

2.3含量測定

2.3.1測定波長選擇吸取沒食子酸對照品溶液、供試品提取液各0.2 mL，置于10 mL瓶中，加60%乙醇各0.4 mL，蒸餾水3 mL，10%福林酚試劑2.5 mL，7.5%碳酸鈉溶液2 mL，加蒸餾水至刻度定容，在暗處反應30 min。以60%乙醇做空白對照，在紫外-可見分光光度計400～800 nm波長處掃描，以確定最大吸收波長，結果沒食子酸和白花蛇舌草總酚在742 nm波長處有最大吸收值。

2.3.2標準曲線繪制分別吸取沒食子酸對照品溶液0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mL，置于10 mL瓶中，按2.3.1項的方法進行顯色，以60 %乙醇溶液為空白，在742 nm波長處測定吸光度，得標準曲線方程：

A＝113.36C+0.0114 r＝0.9993

結果表明沒食子酸在0.82～5.74μg／mL線性關系良好。

2.3.3總酚含量測定按2.2項制備供試品溶液，取樣品液0.2 mL，置10 mL瓶中，按2.3.2項的方法測其吸光度，計算總酚含量，并按下式計算總酚得率：

總酚得率＝總酚的含量／藥材的質量×100%

結果見表1。RSD為0.68%，說明該方法穩定可行。

表1　總酚含量測定

2.3.4精密度試驗取對照品溶液0.2 mL（濃度0.164 mg／mL），按2.3.2項方法測定吸光度，結果見表2。RSD為0.72%，表明方法精密度良好。

2.3.5穩定性試驗取供試品溶液0.2 mL，在0、20、40、60、80、100、120 min，按2.3.2項方法測定吸光度，結果見表3。RSD為1.53%，表明供試品溶液中總酚含量穩定。

表2　精密度實驗

表3　穩定性實驗

2.3.6重復性試驗按2.2項方法制備6份供試品溶液，按2.3.2項方法測定吸光度，結果見表4。 RSD為0.70%，表明方法重復性良好。

表4　重復性的實驗結果

2.3.7回收率試驗精密稱取白花蛇舌草6份，每份0.5 g，分別加入沒食子酸對照品溶液0.2 mL（濃度0.164 mg／mL），按2.2項制備供試品溶液，按2.3.2項測定，結果見表5。計算回收率：

回收率＝（測得量－藥材含有量）／加入量×100%。

加樣回收率平均值為95.76%，RSD為1.54%。

表5　回收率實驗

3　討論

3.1植物多酚的測定方法有多種，我們曾考察普魯士藍法、重氮比色法，均因方法顯色不穩定，或方法步驟復雜而未采用。Folin-Ciocaheu比色法操作較簡單［6］，結果穩定可靠，有利于快速測定大批量樣品，實驗證明Folin-Ciocaheu法符合要求。

3.2由于白花蛇舌草中酚類物質水溶性較差，因此在選擇提取溶劑時，我們考察了50%、60%、80%乙醇作為提取溶劑，最終采用60%乙醇為溶劑，所得的溶液顯色后測定結果較穩定。

總之，Folin-Ciocaheu法重現性好，穩定、可行，可為白花蛇舌草的質量控制提供實驗依據。

［1］紀寶玉，范崇慶，裴莉昕，等.白花蛇舌草的化學成分及藥理作用研究進展［J］.中國實驗方劑學雜志，2014，20（19）：235-240.

［2］林久茂，彭軍，魏麗慧，等.白花蛇舌草提取物誘導結腸癌HT-29細胞凋亡的機制研究［J］.福建中醫藥，2010，41（5）：49-51.

［3］林久茂，魏麗慧，李瓊瑜，等.白花蛇舌草通過調控Wnt／βcatenin通路抑制大腸癌細胞及大腸癌干細胞的生長［J］.中華中醫藥雜志，2015，30（5）：1805-1808.

［4］CAIQ，LIN J，WEI L，et al.Hedyotis diffusa Willd inhibits colorectal cancer growth in vivo via inhibition of STAT3 signaling pathway［J］.International Journal of Molecular Sciences，2012，13（5）：6117-6128.

［5］楊璐，努爾比耶，李宏.新疆紅棗果實不同部位總酚的含量測定［J］.食品研究與開發，2016，37（1）：152-156.

［6］張科衛，馬彩霞，繆六舒.Folin-Ciocaileu比色法測定不同產地生姜中總酚［J］.中成藥，2012，34（12）：2450-2452.

R284.1

B

1000-338X（2016）05-0031-02

2016-07-16

教育部博士點基金資助課題（20133519110003），陳可冀中西醫結合發展基金資助課題（CKJ2015007、CKJ2014013）

林珊（1981—），女，醫學碩士，主要從事中西醫結合基礎研究。

林久茂（1976—），男，副研究員。E-mail:jiumaolin@hotmail.com