云南松松塔二萜類成分的指紋圖譜研究

吳道勛，劉　璐，劉　熙，馬　嬌，王　瑩，張海珠*

（1.大理大學藥學與化學學院，云南大理671000；2.云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南大理671000；3.滇西應用技術大學，云南大理671000）

云南松松塔二萜類成分的指紋圖譜研究

吳道勛1，2，劉璐1，劉熙1，2，馬嬌3，王瑩1，2，張海珠1，2*

（1.大理大學藥學與化學學院，云南大理671000；2.云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南大理671000；3.滇西應用技術大學，云南大理671000）

目的：通過比較不同產地云南松松塔中二萜類成分的HPLC指紋圖譜，分析不同采樣地點的云南松松塔是否具有差異性。方法：采集云南省不同產地的云南松松塔樣品20份，通過HPLC法建立云南松松塔中二萜類化合物的指紋圖譜，對其指紋圖譜中的共有峰進行標記。結果：確立了云南松松塔二萜類化合物色譜指紋圖譜的高效液相分析條件，確定11個共有峰。不同產地的云南松松塔的二萜類化合物色譜指紋圖譜存在一定差異。結論：采用HPLC法，制定云南松松塔的二萜類化合物色譜指紋圖譜，其二萜類成分得到較好的分離度，方法穩定、準確度高、重現性好，為云南松松塔質量標準研究奠定基礎。

云南松；松塔；二萜類化合物；HPLC法

［DOI］10.3969/j.issn.2096-2266.2016.10.005

松科松屬植物全世界約100種，分布于北半球至北極圈。全國常見的松樹約18種，主要分布在云南的云南松Pinus yunnanensis Franch.資源十分豐富。松塔是松科植物的球果，《本草綱目》記載了松塔具有祛痰、止咳平喘、祛風、潤腸、安神等功效。松塔含有多種具有藥理活性的成分，作為藥物可以治療風濕病，還具有抗感染、抗菌、抗病毒等功效。但是，這一豐富的資源并沒有得到重視和利用，每年至少有上萬噸的云南松松塔廢棄于山林中或被農民當作燃料燒掉。

國內大量學者對松塔進行了化學成分的研究，其中周萍等研究了其木質素-糖復合物中的含糖量〔1〕；劉光明等對其作了抗HIV活性成分的研究〔2〕；張志琴等研究了其莽草酸的提取工藝〔3〕；李寅珊等對其化學成分進行了研究〔4〕；呂小滿等對其化學成分及生物活性的研究展開了一次綜合性的論述〔5〕；經研究還發現松塔的抗癌活性成分具有高效、低毒的特點〔6-7〕。由此可見，松塔的化學成分及其藥理活性，具有很好的研究潛力與研究價值，可為其今后的藥用開發利用奠定基礎。

李寅珊等從云南松松塔中分離出二萜類化合物〔4，8-10〕。二萜類化合物具有多種藥理活性，如∶抗腫瘤〔11〕、鎮痛〔12〕、抗血小板凝結〔13〕等。上述研究對松塔中的化學成分做了大量基礎性的探索工作，但國內外均未見與本項目所涉及的對云南松松塔中二萜類化合物的指紋圖譜的相關研究報道。因此，本實驗采用靈敏度和準確度高的HPLC法，建立其二萜類成分的色譜指紋圖譜，標記其共有峰，并計算相似度，以多指標成分替代單一指標成分，全面控制其質量，為其質量標準的建立及藥用資源的開發利用奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象采于云南省各地（大理、昭通、曲靖等地）云南松松塔20份。標本由大理大學段寶忠副教授鑒定為云南松松塔（P.yunnanensis Franch.），粉碎，過60目篩，置于陰暗處備用。

1.1.2實驗儀器與試劑Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；AL104電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ5200DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀有限公司）；旋轉蒸發儀RE-3000（上海亞榮生化儀器廠）。流動相甲醇（色譜純，Merck公司）；其他試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1色譜條件Phenomenex Gemini C18（250 mm ×4.60 mm，5 μm）色譜柱；甲醇-0.5%磷酸水溶液為流動相梯度洗脫。見表1。流速1 mL/min；柱溫30℃；檢測波長241 nm，進樣量10 μL〔4，9，14-15〕。

表1　梯度洗脫

1.2.2供試品溶液的制備稱取松塔粉末2.0 g，置50 mL圓底燒瓶中，加入30 mL無水丙酮浸泡提取12 h，過濾，減壓濃縮，回收丙酮，得浸膏，用適量甲醇溶解，置于25 mL量瓶中，并用甲醇定容至刻度，即得供試品液。

1.2.3精密度試驗取同一供試品液，連續進樣6次，記錄結果。

1.2.4穩定性試驗取同一供試品液，每隔4 h進樣1次，連續進樣6次，記錄結果。

1.2.5重復性試驗取同批樣品6份，按照“1.2.2”供試品溶液制備方法進行制備，測定，記錄結果。

1.2.6樣品來源見表2。

2　結果與分析

2.1精密度試驗結果取同一供試品液，連續進樣6次。結果表明，11個共有峰的相對保留時間的RSD為1.57%，精密度良好。

2.2穩定性試驗結果取同一供試品液，分別在0、4、8、12、16、20 h進樣6次。結果表明，11個共有峰的相對保留時間的RSD均小于3%，相對峰面積的RSD為2.36%，表明20 h內供試液溶液穩定性較好。

表2　樣品來源

2.3重復性試驗結果取同批樣品6份，按照“1.2.2”供試品溶液制備方法進行操作，測定。11個共有峰的相對保留時間的RSD均小于3%，相對峰面積的RSD為2.76%，表明此方法重現性良好。

2.4指紋圖譜的建立及分析

2.4.1共有峰的標定根據20批樣品測定所得結果表明∶云南松松塔丙酮冷浸提取共標定11個共有峰作為特征峰構成指紋圖譜。共有峰及相對保留時間結果見表3～4；指紋圖譜見圖1。

2.4.2非共有峰面積比值統計計算各樣品非共有峰與總峰面積比值，結果顯示，非共有峰面積占總峰面積百分比均小于5%，符合指紋圖譜的技術要求。

2.4.3各地云南松松塔二萜類化合物指紋圖譜相似度20批樣品的圖譜相似度分別為∶0.965、0.927、0.965、0.965、0.965、0.873、0.873、0.927、0.965、0.927、0.927、0.977、0.977、0.906、0.873、0.873、0.949、0.949、0.855、0.704。

表3　不同樣品共有指紋峰相對峰面積

表4　不同樣品共有指紋峰相對保留時間

續表4

圖1　云南松松塔HPLC指紋圖譜

3　討論

3.1提取方法查閱文獻得出，在提取二萜類化合物時，多采用熱回流方法，此方法操作時間長，實驗操作繁瑣，溶劑損失量大，容易造成提取物的損失〔16-18〕。本實驗采用丙酮冷浸法，提取二萜類化合物，提取效率高，操作簡便，適宜推廣〔14〕。

3.2流動相的選擇文獻中〔14，16-17，19〕，流動相多采用乙腈-冰醋酸、甲醇-冰醋酸、乙腈-磷酸，正己烷-醋酸乙酯-乙腈等系統，但乙腈價格較昂貴，本實驗中將流動相優化以甲醇-0.5%磷酸水溶液梯度洗脫，分離效果良好，且價格低廉，實用性強。

綜上所述，對不同采集地點的云南松松塔中二萜類化合物的指紋圖譜的研究得出，不同產地的云南松松塔的指紋圖譜有一定差異，同一采集地點的大理市斜陽峰的也存在一點差異，可能是由于生長環境、氣候因素、采集時間等原因造成。因此，今后應進一步加強對云南松的研究觀測，為其今后的藥用價值的開發利用奠定基礎。

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〔3〕張志琴，劉光明，楊永壽，等.云南松松塔中莽草酸的提取工藝研究〔J〕.安徽農業科學，2011，39（30）：18512-18513.

〔4〕李寅珊，李冬梅，蔣凌云，等.云南松松塔的化學成分〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2012，18（2）：119-121.

〔5〕呂小滿，胡艷芬，劉光明，等.松塔化學成分及生物活性的研究進展〔J〕.醫學綜述，2010，16（7）：1071-1073.

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Study on Fingerprints of Diterpenoid Compound in the Pine Cone of Pinus yunnanensis Franch

Wu Daoxun1，2，Liu Lu1，Liu Xi1，2，Ma Jiao3，Wang Ying1，2，Zhang Haizhu1，2*
（1.College of Pharmacy and Chemistry，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China；2.Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D，Dali，Yunnan 671000，China；3.West Yunnan University of Applied Sciences，Dali，Yunnan 671000，China）

Objective:To compare the HPLC fingerprints of diterpenoid compound in pine cones of Pinus yunnanensis Franch from different habitats，and to analyze the differences among the pine cones from different sampling sites.Methods:20 pine cone samples of Pinus yunnanensis Franch from different places in Yunnan were collected and the fingerprints of diterpenoid compound in the pine cone of Pinus yunnanensis Franch were established through HPLC method with the marking the common peak.Results:High performance liquid chromatography analysis condition of the fingerprints of diterpenoid compound in pine cones of Pinus yunnanensis Franch were established and 11 common peaks were confirmed.There are differences among the chromatographic fingerprints of diterpenoid compound in pine cones of Pinus yunnanensis Franch from different places.Conclusion:HPLC method is used to develop chromatographic fingerprint of diterpenoid compound in pine cone of Pinus yunnanensis Franch with good resolution of diterpenoid，which lays the quality specification study foundation of pine cone of Pinus yunnanensis with a stable，accurate and reproducible method.

Pinus yunnanensis Franch；pine cone；diterpenoid；HPLC method

R284

A

2096-2266（2016）10-0018-05

（責任編輯李楊）

國家自然科學基金資助項目（81260632；81450053）；云南省教育廳科學研究基金資助項目（2014Z132）

2015-08-23

2016-03-08

吳道勛，碩士研究生，主要從事天然藥物質量控制研究.

*通信作者：張海珠，副教授.