大理白族老年人2型糖尿病與線粒體ND1基因T3394C突變的相關性

楊勇琴，楊澤芳，陳亞麗，歐陽文軍，楊佳妮，張曉娟，熊　偉*

（1.大理大學基礎醫學院，云南大理671000；2.云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南大理671000；3.大理大學大理教學醫院呼吸內科，云南大理671000）

大理白族老年人2型糖尿病與線粒體ND1基因T3394C突變的相關性

楊勇琴1，2，楊澤芳1，陳亞麗1，歐陽文軍1，楊佳妮1，張曉娟3，熊偉1，2*

（1.大理大學基礎醫學院，云南大理671000；2.云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南大理671000；3.大理大學大理教學醫院呼吸內科，云南大理671000）

目的：研究人線粒體呼吸鏈煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）脫氫酶第一亞單位（ND1）基因3394位點T→C突變與我國云南大理白族老年人2型糖尿病的相關性。方法：隨機抽取無血緣關系的云南大理白族200例老年2型糖尿病患者（糖尿病組）及218例無糖尿病家族史、糖耐量正常的老年人群（正常對照組），用聚合酶鏈反應擴增、限制性內切酶HaeⅢ消化進行點突變篩查。結果：糖尿病組中5例患者存在線粒體DNA ND1基因3394位點T→C突變（2.50%），正常對照組中僅有1例出現該位點突變（0.46%），兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。線粒體ND1基因3394位點T→C基因突變的糖尿病患者具有明顯的母系遺傳特征。結論：線粒體ND1基因3394位點T→C突變與云南省大理白族老年人2型糖尿病患者發病相關。

線粒體ND1基因；2型糖尿病；T3394C突變；白族

［DOI］10.3969/j.issn.2096-2266.2016.10.008

人線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）為16 569 bp的環狀雙鏈DNA分子，共編碼37個基因，包括13個呼吸鏈復合體亞單位的基因、2個rRNA基因（12S rRNA和16S rRNA）和22個tRNA基因，具有母系遺傳的特征。tRNALeu（UUR）基因為線粒體糖尿病的“突變熱點”，尤其以A3243G位點突變最為多見，1997年美國糖尿病協會已將這類糖尿病分型為胰島β細胞功能遺傳缺陷性糖尿病〔1〕。

線粒體被稱為細胞的“動力工廠”，是細胞內通過氧化磷酸化合成ATP的主要場所。編碼線粒體煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）脫氫酶第一亞基（ND1）的基因突變可能導致線粒體呼吸鏈復合體I酶活性降低，細胞內ATP合成減少，進而影響胰島β細胞合成和分泌胰島素，促進糖尿病的發生〔2〕。2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）是臨床最常見的糖尿病類型，門診的糖尿病人中，90%以上都屬于2型糖尿病，多發于肥胖的中老年人。國內外研究表明，不同種族和不同地區的人群中，線粒體基因組許多不同位點的基因點突變均可能與老年人2型糖尿病的發生有關〔3-6〕。目前，線粒體DNA的ND1基因T3394C點突變是否與我國白族老年人群2型糖尿病的發生相關尚無報道。基因多態性有顯著的種族差異，在環境-基因相互作用模式上，不同的種族之間有可能有較大差異。因此，本研究利用大理地區特有的資源優勢，開展云南大理地區白族老年人群2型糖尿病的發生與線粒體ND1基因T3394C點突變相關性的研究工作，現報道如下。

1　材料與方法

1.1研究對象選取2014年1月至2015年9月在大理市第一人民醫院和云南省第四人民醫院就診的200例大理本地白族老年糖尿病患者作為糖尿病組，男83例，女117例。年齡60～81歲，平均年齡（66.7±8.4）歲。對照組選取218例，男102例，女116例，年齡60～85歲，平均年齡（67.4±7.9）歲，糖耐量正常且無糖尿病家族史，無急性心腦血管疾病、急性應激狀況及內分泌系統疾病。兩組患者性別、年齡及體重指數差異無統計學意義，具有可比性。以上研究個體之間無血緣關系，追溯3代均為同一民族個體，且在云南大理地區居住3代以上。所有的檢查以及標本的收集手續和過程均按照赫爾辛基宣言要求的原則進行，并獲大理大學醫學倫理委員會批準，嚴格按照其規定的程序進行，同時得到患者的知情同意〔7〕。常規抽取外周靜脈血，進行基因組DNA提取。

1.2儀器及試劑

1.2.1儀器2720 Thermal Cycler型號PCR擴增儀（美國Applied Biosystems公司）；凝膠成像儀（美國BIO-RAD公司）；DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）；生物安全柜（蘇州安泰空氣技術有限公司）；全自動滅菌鍋（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；DYCZ-24D蛋白電泳槽（北京六一儀器廠）；HH-4恒溫水浴鍋（上海國華電器有限公司）；微量移液器（德國Eppendorf公司）。

1.2.2試劑哺乳動物全血基因組DNA提取試劑盒（北京天根生物科技公司）；限制性核酸內切酶HaeⅢ（美國NEB公司）；Taq DNA聚合酶（大連Takara公司）；DNA Marker（90602C）（四川綿陽天恩澤基因工程有限公司）；DuRed核酸染料（北京全式金公司）；瓊脂糖（Biowest Agarose）為西班牙進口分裝；乙醇、異丙醇等化學試劑均為國產分析純。

1.3方法

1.3.1引物設計及合成引物設計參照人mtDNA劍橋序列（GenBank∶J01415），由昆明碩擎生物技術有限公司合成（PAGE級純化，純度99%）。上游引物（Forword）序列為5'-GGATCAGGACATCCCGAT-3'，下游引物（Reverse）序列為5'-GGTTTTAGGGG CTCTTTGG-3'。

1.3.2基因組DNA提取取外周靜脈血2 mL，加入0.2 mL EDTA-K2抗凝。采用哺乳動物全血基因組DNA提取試劑盒，按照說明書提取外周血總DNA，NanoDrop核酸蛋白分析儀測定DNA濃度和純度。

1.3.3聚合酶鏈反應擴增-限制性酶切片段多態性分析（PCR-RFLP）PCR反應體系為∶DNA模板（50 ng/μL）1 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，上游引物和下游引物各1 μL，加雙蒸水補充至總體積25 μL。PCR反應條件為∶95℃預變性5 min后進入循環，每個循環為95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸50 s，共循環35次，最后72℃延伸5 min，4℃保存。取PCR反應產物10 μL加至2 μL的6×loading buffer中混勻，加樣于1.5%瓊脂糖凝膠，恒壓120 V，于1×TAE緩沖液中電泳30 min，凝膠成像系統觀察有無PCR產物。HaeⅢ限制性內切酶于37℃恒溫水浴中酶切PCR產物30 min，15%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳酶切產物，DuRed核酸染料染色，凝膠成像系統顯影觀察。

1.3.4DNA測序將5例疑似突變陽性的T2DM組標本及8例無突變的正常對照組標本的PCR產物送昆明碩擎生物技術有限公司進行DNA純化和測序。

1.3.5T2DM組患者臨床資料收集記錄T2DM組和正常對照組個體的性別、年齡、起病年齡、家族史、體重指數（BMI）、空腹血糖（FBG）、餐后2 h血糖（P2BG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、血清C肽（F-C peptide）及治療方法（飲食、口服降糖藥或胰島素治療）〔8〕。

2　結果

2.1線粒體DNA片段的PCR擴增利用合成的引物分別對T2DM組和正常對照組樣本的基因組DNA進行PCR擴增，預期目的片段大小為266 bp，1.5%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示擴增效果良好，與預期片段大小相符，沒有非特異性條帶的出現。見圖1。

圖1　mtDNA ND1基因片段的PCR擴增結果

2.2PCR-RFLP檢測線粒體tRNALeu（UUR）基因T3394C突變∶通過PCR-RFLP分析（HaeⅢ/3394），野生型經HaeⅢ內切酶水解，可以得到169、97 bp兩個酶切片段，當3394發生T→C突變后（酪氨酸→組氨酸），新增的酶切位點將97 bp切割為80、17 bp兩個片段，因此T3394C突變個體最終可得到169、80、17三個片段。配制15%的聚丙烯酰胺凝膠，120 V穩壓電泳約2 h，電泳結束后核酸染料染色，于凝膠成像系統拍照，實驗結果表明∶200例T2DM組患者中共檢出5例T3394C突變，其中3例為線粒體DNA異質性突變，2例為線粒體DNA同質性突變。218例正常對照組中有1例T3394C突變，為線粒體DNA異質性突變。見圖2。

圖2　非變性PAGE電泳檢測線粒體ND1基因T3394C突變

2.3線粒體DNA T3394C突變分析在200例T2DM組患者中共檢出5例T3394C突變，突變率為2.50%，218例正常對照組中有1例突變，突變率為0.46%，T3394C突變率在兩組間差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.4突變與家族史的關系兩組人群中可見明顯的DM家族史（χ2=1.041，P＜0.05）和母系遺傳傾向（χ2=3.840，P＜0.01）。見表1。

表1　線粒體ND1基因突變與糖尿病家族史的關系

2.5糖尿病組患者臨床資料比較T2DM組患者分為T3394C突變陽性組和T3394C突變陰性組，兩組之間在性別、年齡、BMI、FBG、P2BG、HbA1c、血清C肽及治療方法方面差異無統計學意義（P＞0.05），但兩組之間的起病年齡差異具有統計學意義（P＜0.01）。見表2。

2.6DNA測序結果將T2DM組5例疑似突變陽性標本及正常對照組8例無突變標本的PCR產物進行純化后直接正向測序，對有T3394C突變的標本再次進行反向測序驗證，證明所有T2DM組樣本的T3394C突變結果可靠。見圖3。

圖3　PCR產物直接測序結果

3　討論

線粒體DNA直接暴露在氧化磷酸化過程所產生的自由基中，同時組蛋白保護的缺乏，DNA修復酶的相對不足，因此線粒體DNA比核DNA更容易受到損傷，突變率比核DNA高10～20倍，在老年人群中突變率尤為高〔9〕。60歲以上的人群中糖尿病的患病率超過10%，糖尿病總人群的50%以上為老年糖尿病患者〔10〕。線粒體ND1基因T3394C突變是一種錯義突變，可引起線粒體呼吸鏈ND1亞單位中的一個中性的酪氨酸被親水性的組氨酸取代。該突變可改變ND1空間構型，使NADH脫氫酶活性下降，ATP合成減少，導致胰島β細胞能量供應不足，從而影響胰島素分泌，參與2型糖尿病的發生〔11〕。

1996年，HIRAI等首次報道日本2型糖尿病患者群存在mtDNA T3394C突變，其突變率為4.90%，正常人群為1.30%〔12〕。國內外不同的研究表明，線粒體ND1基因T3394C突變在T2DM人群中發生率為3.00%～6.00%，在正常對照組人群發生率為0.00%～2.06%〔13-15〕。本研究結果顯示大理白族老年人2型糖尿病組中線粒體ND1基因T3394C突變率為2.50%，正常對照組中基因突變率僅為0.46%，組間差異有統計學意義，從而認為線粒體ND1基因3394T→C突變與大理白族老年2型糖尿病的發病相關。進一步分析老年2型糖尿病ND1基因T3394C突變患者的臨床資料，發現該位點突變并沒有影響到糖尿病患者的BMI、FBG、P2BG、HbA1c、血清C肽的變化及治療方法等方面。但是，線粒體ND1基因T3394C突變陽性組糖尿病患者的起病年齡比突變陰性組患者更低，兩組差異極顯著，且突變陽性患者的母系遺傳特征明顯。

目前對于云南大理白族人群線粒體遺傳結構與其他地區民族的差異及其與相關疾病關系的研究還不是特別清楚，本實驗初步明確了線粒體ND1基因T3394C突變與這一群體中老年2型糖尿病患者之間的相關性，對大理白族老年人2型糖尿病的治療指導和病情預測具有一定的指導意義。本研究表明，線粒體ND1基因T3394C點突變可能是云南大理老年白族人群2型糖尿病的致病因素，在多因素的共同作用下，誘導糖尿病的發生，且具有母系遺傳的特點。

綜上所述，老年人2型糖尿病的病因復雜，國內外不同民族由于遺傳背景和生活方式等多方面的不同，導致線粒體DNA突變率存在較大差異，需要更多樣本的深入研究來進一步證實，為老年人2型糖尿病患者提供風險預報〔16〕。本研究對大理白族地區老年人2型糖尿病早發現、早治療、減少糖尿病并發癥的發生具有一定的臨床意義。

表2　T2DM患者線粒體ND1基因突變（+）和突變（-）組間臨床資料比較

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The Correlation between Point Mutation of T3394C in Mitochondrial ND1 Gene and Patients with Type 2 Diabetes Mellitus in Aged Bai Minorities in Dali

Yang Yongqin1，2，Yang Zefang1，Chen Yali1，Ouyang Wenjun1，Yang Jiani1，Zhang Xiaojuan3，Xiong Wei1，2*
（1.Pre-clinical College，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China；2.Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D，Dali，Yunnan 671000，China；3.Respiratory Department，Dali Teaching hospital of Dali University，Dali，Yunnan 671000，China）

Objective:To investigate the correlation between point mutation of T3394C in mitochondrial NADH ND1 gene and patients with type 2 diabetes mellitus in aged Bai minorities in Dali.Methods:200 unrelated individuals with type 2 diabetes mellitus（T2DM group）which were randomly chosen among aged Bai minorities in Dali，Yunnan，and 218 aged cases with normal glucose tolerance without DM family history（Control group）were inspected.Polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP）technology were used for screening.Results:The point mutation T3394C in mitochondrial ND1 gene were found in 5 cases in T2DM group（2.50%），while only 1 case in control group（0.46%），and there were significant differences between two groups（P＜0.05）.Mitochondrial ND1 gene T3394C point mutation in patients with type 2 diabetes mellitus showed obvious maternal inheritance characteristics.Conclusions:The point mutation of T3394C in the mitochondrial DNA ND1 gene may be related to the occurrence of T2DM in aged Bai minorities in Dali.

mitochondrial ND1 gene；type 2 diabetes mellitus；T3394C mutation；Bai minority

R587.1

A

2096-2266（2016）10-0030-05

（責任編輯李楊）

國家自然科學基金資助項目（81560458）；云南省教育廳科學研究基金資助項目（2014Z126）；大理大學基礎醫學院大學生科研基金資助項目（201502）；云南省大學生創新創業計劃資助項目（201408）；大理大學博士科研啟動基金資助項目（BSKY2012018）

2015-12-09

2016-02-29

楊勇琴，講師，主要從事基礎醫學研究.

*通信作者：熊偉，副教授，博士.