肝癌經TAE術后肝細胞中PPAR-α的表達

張　靚，王光明，唐艷隆，劉　玲，杜　偉*

（1.大理大學大理非直屬附屬醫院，云南大理671000；2.大理大學第一附屬醫院，云南大理671000）

肝癌經TAE術后肝細胞中PPAR-α的表達

張靚1，王光明2，唐艷隆2，劉玲2，杜偉2*

（1.大理大學大理非直屬附屬醫院，云南大理671000；2.大理大學第一附屬醫院，云南大理671000）

目的：探討PPAR-α在肝癌經肝動脈栓塞術（TAE）后肝功能異常中的作用機制。方法：建立新西蘭大白兔VX2肝癌動物模型26只，模型成功率為86%（24/28），將兔VX2肝癌動物模型隨機分為栓塞組12只，造影組12只，TAE術后8 h各組兔同時處死，取腫瘤旁取正常肝組織，制作石蠟切片，進行HE染色以及免疫組化，檢測PPAR-α在肝組織中的表達。結果：栓塞組陽性細胞數介于51%～85%，陽性評估為++/+++，造影組陽性細胞數介于10%～30%，陽性評估為+/++。統計學分析表明TAE術后，癌旁肝組織中PPAR-α的表達明顯高于造影組（P＜0.05）。結論：TAE后，PPAR-a在腫瘤周圍肝細胞中的表達明顯增加，可能機制為癌旁正常肝組織缺血缺氧，從而導致PPAR-α高表達。

PPAR-a；肝癌；動脈栓塞術；肝功能

［DOI］10.3969/j.issn.2096-2266.2016.10.018

原發性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）是我國最為常見的惡性腫瘤之一，近幾年來發病有增多趨勢，由于80%的PHC患者發現時已屬于晚期，經動脈栓塞術（transcatheter arterial embolization，TAE）是臨床經常運用的手段之一。但TAE可造成不同程度的肝功能損傷，甚至肝功能衰竭〔1〕。過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs）屬于Ⅱ型核激素受體超家族，目前發現有3種亞型∶PPAR-α、PPAR-β、PPAR-γ〔2〕，PPAR-α主要在肝、心、腎近曲小管、棕色脂肪等組織，其中在肝細胞表達較高，參與肝細胞各項生理過程以及疾病的發生和發展，PPAR-α作為上游因子，調控多種因子的表達，從而調節肝細胞的增殖與凋亡、炎性反應、氧化應激以及脂肪代謝。本研究在建立兔腫瘤細胞（VX2）移植性肝癌模型的基礎上，觀察兔VX2移植性肝癌行TAE術后肝細胞PPAR-α的表達，旨在探討PPAR-α在肝癌行TAE后肝功能異常中的作用機制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物荷瘤兔2只（東南大學醫學院附屬醫院提供），新西蘭大白兔28只，質量為2.7～3.1 kg，平均為2.9 kg，性別不限，由大理大學動物實驗中心提供。

1.1.2器材和試劑介入器材有21G穿刺針系統、4F單彎導管、0.032 inch超滑導絲、4F導管鞘和3F SP微導管（Turomu Japan）；影像設備有CT機（Brlliance 16 slice，Philips）及DSA機（Integris alluran，Philips）；包埋機、病理切片機、烤片機、烤箱、冰箱、高壓鍋、載玻片及蓋玻片等（大理大學第一附屬醫院病理科提供）；PPAR-α多克隆抗體（Novusbiologicals），小鼠IgG免疫組化試劑盒SV0001（武漢博士德生物技術有限公司），DAB顯色劑（Sigma公司）。

1.2實驗方法

1.2.1建模方法荷瘤兔傳代及VX2肝癌模型建立，采用改良CT下定位瘤塊注射法〔3〕，分別于接種7、14、21、28 d進行CT檢查，全麻后仰臥固定，掃描條件為90 kV，100 mA，層厚2.5 mm，增強掃描由耳緣靜脈注入對比劑，對比劑總劑量為8 mL（4 mL碘海醇+4 mL生理鹽水），注射速度1 mL/s，成功造模24只癌兔，造模成功率為86%（24/28）。

1.2.2經導管股動脈造影、栓塞及分組VX2肝癌兔全麻仰臥固定，雙側腹股溝區備皮，常規消毒鋪巾，于股動脈搏動明顯處縱形切開皮膚后鈍性分離出股動脈，遠心端結扎固定，采用Seldinger技術穿刺股動脈置入血管鞘，單彎導管頭端選擇至肝腹腔干后行數字減影血管造影（digital subtraction angiography，DSA），顯示腫瘤血管呈“抱球征”改變，對比劑總量5～6 mL，流率2 mL/s。根據腫瘤部位和供血動脈，用SP微導管超選入腫瘤供血動脈，盡可能避開正常肝組織供血支。

將肝癌模型兔隨機分為2組，栓塞組12只，造影組12只，栓塞組是在確定腫瘤血管后注入碘化油1～2 mL進行栓塞，造影組不注入碘化油栓塞。栓塞組及造影組術后拔管，結扎股動脈，縫合切口，術后肌注慶大霉素抗感染。

1.3病理學檢查兩組的標本均取自病灶邊緣肝組織，用10%的福爾馬林固定后石蠟包埋切片，切片厚度為4 μm。

1.3.1HE染色步驟切片放入60℃烤箱30～60 min；脫蠟∶二甲苯1（5 min）→二甲苯2（5 min）→無水酒精（2 min）→95%酒精（2 min）→90%酒精（數秒）→75%酒精（數秒）→流水沖洗；染色∶蘇木素（4 min）→流水沖洗→1%鹽酸乙醇分化（數秒）→流水沖洗→伊紅浸染（數秒）→流水沖洗→梯度脫水、透明、樹膠封片。

1.3.2免疫組化步驟采用Super Vision兩步免疫組化法，切片放入60℃烤箱30～60 min使切片緊密黏附，脫蠟；3%H2O2，室溫10 min，蒸餾水洗3次，EDTA抗原修復10 min，3%BSA封閉10 min，甩去多余液體，不洗滴加適當稀釋的一抗（1∶2 000）40 μL 4℃過夜，PBS沖洗3次。滴加聚合HRP標記抗小鼠IgG 37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，DAB（1∶50）顯色，室溫顯色。鏡下控制反應時間，一般5～10 min。蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復染、脫水、透明、封片。以緩沖液（PBS）代替1抗作為陰性對照。

1.4結果判定

1.4.1HE染色顯微鏡下觀察肝細胞排列、形態以及間質改變，有無炎性細胞及凋亡細胞。

1.4.2免疫組化每張切片隨機選取5個40倍視野，計數陽性細胞（胞核著色）及染色強度。根據陽性細胞數和染色強度綜合評分，著色強度評分∶無色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；陽性細胞百分數評分∶0為0分，≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。著色強度評分和陽性細胞百分數相加得出總評分∶0～1分為陰性（－），2～3分為弱陽性（+），4～5為陽性（++），＞6為強陽性（+++）。

2　結果

肝癌栓塞組與造影組比較，TAE術后大部分肝細胞胞漿淡紅，核深染、固縮、碎裂，部分形成空泡，周圍可見中性粒及淋巴細胞浸潤。見圖1。

圖1　造影組與栓塞組肝組織HE染色結果

PPAR-α表現為胞核著色，呈現淡黃至棕褐色顆粒為陽性表現。見圖2。栓塞組棕黃色陽性細胞數介于51%～85%，陽性評估為++/+++，造影組陽性細胞數介于10%～30%，陽性評估為+/++。統計學分析表明TAE術后，癌旁肝組織中PPAR-α的表達明顯高于造影組（P＜0.05）。見表1。

圖2　造影組與栓塞組肝組織PPAR-α的表達

表1　PPAR-α在栓塞組與造影組的癌旁肝組織中的表達

PPAR-α在造影組陽性細胞數為27%±12%，在栓塞組癌旁肝組織表達為68%±15%，經統計學處理P＜0.05，兩組的差異具有統計學意義。

3　討論

PHC是世界常見惡性腫瘤，也是我國第二大腫瘤〔4〕。TAE是一種安全有效的治療手段，可以延長晚期PHC患者的生存時間，提高患者的生活質量。它是將微導管超選擇性插入到腫瘤的靶血管中，然后注入栓塞材料，對其供血動脈進行栓塞。TAE以其副反應小、手術創傷小、可以縮小病灶、為患者爭取進一步手術切除的機會等優勢〔5-6〕，在臨床得到廣泛地應用。臨床試驗及Meta分析均顯示TAE與最好的內科支持治療相比，可明顯提高患者生存率，而對于原發腫瘤伴肝轉移的患者，也能夠提供進一步治療的機會，延長患者生存期〔7〕。

TAE在發揮抑制腫瘤生長、使腫瘤病灶壞死縮小作用的同時，也會造成不同程度的肝功能損傷〔8〕。肝功能損傷的發生率介于22.4%～66.7%之間，它是TAE術后影響患者恢復的重要因素〔8〕。此外，PHC患者肝硬化的發生率高達70%～90%，基礎肝功能往往較差，TAE術后可能造成肝衰竭的發生，患者的生存期易受到影響。而現有文獻更多地關注TAE對腫瘤患者生存期的影響，反而對肝功能異常對生存期的影響沒有足夠重視。因此，如何減輕術后肝功能的損傷，提高TAE術后患者的生存期，是我們介入醫師需要考慮的問題。

正常肝組織的血供雖然主要來自門靜脈，但肝癌組織的血供主要來自肝動脈。TAE治療過程中的導絲、導管物理損傷以及常用的栓塞劑（如碘化油等）的化學損傷，會造成血管的痙攣、堵塞，引起癌組織及癌旁肝組織的缺血缺氧。在筆者前期肝癌模型建立行TAE治療過程中，CT檢查發現部分造影劑以及栓塞劑可彌散進入周圍正常肝細胞中，可能對肝細胞有一定的損傷。缺血缺氧過程激活了一系列復雜的事件以及持續產生內源性的變化，從而引起肝細胞凋亡、壞死，肝組織損傷，肝功能異?！?〕。堵塞的血管將引發炎癥反應和產生氧自由基〔10〕，炎癥反應將導致肝細胞損傷，從而破壞肝細胞，增多的炎癥因子、趨化因子以及黏附因子等進入周圍肝實質內而使肝組織進一步損傷；氧自由基也可直接引起肝組織損傷，促進細胞凋亡，同時可激活基質蛋白金屬蛋白酶-9（MMP9）等通路〔11〕。因此，在探討TAE術后肝功能異常時應該考慮改善肝缺血、抑制炎癥反應、減弱氧化應激、維持肝組織結構和功能完整性。我們研究顯示，介入治療后，兩組腫瘤組織中的NF-κB表達無明顯差異，而介入治療后癌旁肝組織的NF-κB表達明顯增強〔12〕，NF-κB表達明顯增強提示其激活了炎癥反應，促炎癥因子、黏附因子的含量升高〔10〕，同時肝內皮細胞和巨噬細胞激活MMP9引起肝組織的損傷〔11〕。

PPAR-α是多種信號通路的交匯點，作為多種因子的上游因子，參與肝細胞的多種生理及病理過程。在肝細胞炎癥、脂肪代謝異常、缺血損傷等均有異常表達〔13〕。研究表明PPAR-α可下調NF-κB、腫瘤壞死因子α（TNF-α）的表達，抑制炎性反應〔13〕，Panigrahy等人在研究PPAR-α與腫瘤發生及治療的機制中發現，PPAR-α主要是通過抑制環氧酶（COX）、氧化酶（NOX）、TNF-α來抑制炎性反應〔14〕，Karuna等人研究酒精性脂肪肝的分子機制表明，PPAR-α低表達參與酒精性肝損傷的發生發展，促進肝細胞脂肪變性，減少乙醇的代謝以及脂肪酸的氧化和轉運〔15〕。Bechmann等〔16〕人在研究中發現，KLF6損失導致PPAR-α蛋白表達的衰減，導致肝脂肪及糖代謝異常，參與非酒精性脂肪肝的發生以及發展。Eliasmiró等通過喂飼PPAR-α的激動劑Wy-14643促進PPAR-α的表達以抑制超氧化物歧化酶（SOD）以及COX的產生，從而減少缺血再灌注對肝細胞的損傷。本研究發現，PPAR-α主要在肝細胞的細胞核中表達，PPAR-α在TAE組的陽性評估強于非栓塞組。PPAR-α的高表達提示我們∶在介入手術中運用碘化油栓塞腫瘤靶血管時，不可避免地對周圍正常肝組織造成阻塞或化學損傷，肝細胞的缺血、缺氧，以及循環再通后產生的缺血再灌注損傷。Kupffer細胞以及肝細胞產生NF-κB調節TNF-α以及白細胞介素（IL-1）等的表達，介導炎性反應，同時通過還原型輔酶Ⅱ（NADPH）氧化酶以及呼吸鏈產生ROS對肝細胞造成損傷。ROS的增多同時可以介導正常肝細胞凋亡。

綜上所述，TAE治療后腫瘤周圍的肝細胞缺血缺氧，導致炎性反應，過氧化物堆積，肝細胞凋亡以及脂肪變性等，引起PPAR-α的表達增加，從而發揮抗炎，抗凋亡以及抗缺血再灌注的損傷以及促進脂肪代謝的作用。

〔2〕PETERS J M，SHAH Y M，GONZALEZ F J.The role of peroxisome proliferator-activated receptors in carcinogenesis and chemoprevention〔J〕.Nature Reviews Cancer，2012，12（3）：181-195.

〔3〕王君東，胡錦波，杜偉.改良方法建立兔VX2肝癌模型及其MRI表現〔J〕.醫學理論與實踐，2013，26（6）：701-702.

〔4〕WANG R，CHEN X Z，ZHANG M G，et al.Incidence and mortality of liver cancer in mainland China：changes in first decade of 21st century〔J〕.Hepatogastroenterology，2015，62（137）：118-121.

〔5〕DE BAERE T，ARAI Y，LENCIONI R，et al.Treatment of Liver Tumors with Lipiodol TACE：Technical Recommendations from Experts Opinion〔J〕.Cardiovasc Intervent Radiol，2015，39（3）：1-10.

〔6〕FIORE F，DEL PRETE M，FRANCO R，et al.Transarterial embolization（TAE）is equally effective and slightly safer than transarterial chemoembolization（TACE）to manage liver metastases in neuroendocrine tumors〔J〕.Endocrine，2014，47（1）：177-182.

翌日上午取回采樣紙，用工業顯微鏡把附著藥液的1.2mm2試紙放大160倍，讀入計算機中，利用圖像處理技術統計上面的霧滴的粒數和當量粒徑；再利用Excel軟件統計和計算平均粒徑的大小及粒數[3]。由于霧滴在采樣紙上的痕跡大致為圓形，應校正為球體直徑，按下列公式計算，即

〔7〕MASSMANN A，RODT T，MARQUARDT S，et al.Transarterial chemoembolization（TACE）for colorectal liver metastases--current status and critical review〔J〕.Langenbecks Arch Surg，2015，400（6）：641-659.

〔8〕SCHNEEWEISS S，HORGER M，KETELSEN D，et al. Complications after TACE in HCC-complications after transarterial chemoembolization（TACE）in hepatocellular carcinoma〕〔J〕.Rofo，2015，187（2）：79-82.

〔9〕WANG Y，XIONG X，GUO H，et al.ZnPP reduces autophagy and induces apoptosis，thus aggravating liver ischemia/ reperfusion injury in vitro〔J〕.Int J Mol Med，2014，34（6）：1555-1564.

〔10〕EL-SHITANY N A，EL-DESOKY K.Cromoglycate，not ketotifen，ameliorated the injured effect of warm ischemia/ reperfusion in rat liver：role of mast cell degranulation，oxidative stress，proinflammatory cytokine，and inducible nitric oxide synthase〔J〕.Drug Des Devel Ther，2015，9：5237-5246.

〔11〕FANG X，TAO D，SHEN J，et al.Neuroprotective effects and dynamic expressions of MMP9 and TIMP1 associated with atorvastatin pretreatment in ischemia-reperfusion rats〔J〕.Neurosci Lett，2015，603：60-65.

〔12〕張靚，杜偉.NF-κB在肝癌介入治療后癌旁肝細胞中的表達〔J〕.大理學院學報，2014，13（10）：42-46.

〔13〕EMANUELA E，RINALDI B，MAZZON E，et al.Anti-inflammatory effect of simvastatin in an experimental model of spinal cord trauma：involvement of PPAR-a〔J〕.Journal of Neuroinflammation，2012，9（1）：81.

〔14〕PANIGRAHY D，KAIPAINEN A，HUANG S，et al.PPARalphaagonistfenofibratesuppressestumorgrowth through direct and indirect angiogenesis inhibition〔J〕. Proceedings of the National Academy of Sciences of the united States of America，2008，105（3）：985-990.

〔15〕KARUNA R，CAROL C A.Molecular mechanism of alcoholic fatty liver〔J〕.Indian Journal of Pharmacology，2012，44（3）：299-303.

〔16〕BECHMANN L P，VETTER D，ISHIDA J，et al.Posttranscriptional activation of PPAR alpha by KLF6 in hepatic steatosis〔J〕.Journal of Hepatology，2013，58（5）：1000-1006.

PPAR-α Expression of Hepatocytes after TAE in Liver Cancer

Zhang Liang1，Wang Guangming2，Tang Yanlong2，Liu Ling2，Du Wei2*
（1.Non-Affiliated Hospital of Dali University in Dali，Dali，Yunnan 671000，China；2.The First Affiliated Hospital of Dali University，Dali，Yunnan 671000，China）

Objective:To investigate the function mechanism of PPAR-α in liver cancer on abnormal liver function after transcatheter arterial embolization（TAE）.Methods:VX2 hepatic cancer model in 26 New Zealand white rabbits model were established with 86%successful rate（24/28）.VX2 hepatic cancer models in rabbits were randomly divided to embolization group（12），angiography group（12）.Rabbits of very group were sacrificed 8 hours after TAE.Liver tissues surrounded HCC were collected to make paraffin section，and the expression of PPAR-α in hepatic tissue was detected after hematoxylin&eosin（HE）staining and immunohistochemistry.Results:Positive cells in embolization group ranged from 51%～85%with a positive assessment++/+++；positive cells in angiography group were between 10%～30%with a positive assessment of+/++.Statistical analysis showed that the PPAR-α expression in cancer adjacent hepatic tissue of embolization group was significantly higher than angiography group（P＜0.05）.Conclusion:After TAE，PPAR-α expression in tumor adjacent hepatic tissue increased significantly.The possible reason of high expression of PPAR-α might be hypoxia ischemia of cancer adjacent normal tissues.

PPAR-α；liver cancer；arterial embolization；liver function

R735.7

A

2096-2266（2016）10-0067-04

（責任編輯董杰）

國家自然科學基金資助項目（81241131）；云南省教育廳科學研究基金資助項目（2013J113）

2014-06-09

2016-05-03

張靚，住院醫師，主要從事放射介入研究.

*通信作者：杜偉，教授，博士.