板栗褐緣葉枯病病原菌協同致病菌

張秀停　趙洋民　王慶華　龔賽　姜淑霞

摘要：對板栗擬莖點霉菌Phomopsis castaneae-mollissimae協同致病菌Ophiognomonia castanea的生物學特性進行了研究。結果表明，O.castanea菌絲在馬鈴薯一板栗葉培養基上生長最好，菌絲生長的適宜溫度為15～28℃，最適溫度為25℃，最適pH為6；最適宜碳源為甘露醇，氮源蛋白胨和牛肉浸膏能促進菌絲生長。

關鍵詞：Ophiognomonia castanea；生物學特性；菌絲生長

中圖分類號：S436.64 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2016）04-0090-04

板栗褐緣葉枯病是近年來在山東板栗產區發生的一種新病害，其病原菌為板栗擬莖點霉菌Phomopsis castaneae-mollissimae。在對板栗褐緣葉枯病的研究中發現，該病斑上還寄生一種Pphiognomonia屬真菌Ophiognomonia castanea。目前，國內對Ophiognomonia屬真菌的研究很少，對O.castanea的研究更未見報道。本試驗對O.castanea的生物學特性進行了研究，并比較了與P.castaneae-mollissima生物學特性的差異，探討兩菌株的生長及致病關系，以期對板栗褐緣葉枯病的防治提供理論基礎和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

發生板栗褐緣葉枯病的板栗葉片，采自山東省泰安市徂徠山林場光華寺林區。供試O.casta-nea菌株為病斑組織分離純化的菌絲，經單菌絲萌發獲得的純菌落，保存于4℃冰箱中備用。

1.2 研究方法

1.2.1 不同培養基對O.castallga菌絲生長的影響 選用PDA培養基（馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000mL）、馬鈴薯一玉米粉培養基（馬鈴薯100g，玉米粉20g，瓊脂20g，水1000mL）、馬鈴薯綜合培養基（馬鈴薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氫鉀3g，硫酸鎂1.5g，瓊脂20g，水1000mL）、玉米粉瓊脂培養基（玉米粉50g，瓊脂20g，水1000mL）、馬鈴薯-板栗葉培養基（馬鈴薯100g，板栗葉20g，葡萄糖20g，水1000mL）、板栗葉培養基（板栗葉20g，葡萄糖4g，玉米粉4g，瓊脂16g，水1000mL）。在供試菌株的菌落邊緣取直徑5mm菌餅，移植到培養基平板中央，25℃恒溫培養，于接種后的第4、7、10、14d用十字交叉法測量菌落直徑。每處理重復5次。

1.2.2 不同碳源對O.castanea菌絲生長的影響 以PDA培養基為基礎培養基，以2%葡萄糖為碳源，分別以相同含碳量的淀粉、蔗糖、甘油、甘露醇、麥芽糖、木糖、果糖替換葡萄糖，配制成含有不同碳源的培養基。其他方法同1.2.1。

1.2.3 不同氮源對O.castanea菌絲生長的影響 以PDA培養基為對照培養基，以3%硝酸鈉為氮源，并以相同含氮量的蛋白胨、甘氨酸、氯化銨、尿素、天冬酰胺、牛肉膏、尿素，配制成含有不同氮源的培養基。其他方法同1.2.1。

1.2.4 不同溫度對O.castallga菌絲生長的影響 在供試菌株的菌落邊緣取直徑5mm菌餅，移植到PDA培養基平板中央，分別置于5、15、20、25、28、30、35℃等7個不同溫度梯度下培養。其他方法同1.2.1。

1.2.5 不同pH值對O.castanea菌絲生長的影響 將PDA培養基用滅菌的NaOH溶液和HCl溶液分別調pH值至3、4、5、6、7、8、9。其他方法同1.2.1。

2 結果與分析

2.1 不同培養基對O.castanea菌絲生長的影響

試驗結果（圖1）表明，馬鈴薯一板栗葉、馬鈴薯一玉米粉、PDA、馬鈴薯綜合、玉米粉瓊脂和板栗葉培養基14d平均直徑分別為3.43、2.85、2.41、1.64、1.62cm和1.44cm。馬鈴薯一板栗葉培養基長速顯著快于其他培養基，菌絲生長旺盛，濃白，氣生菌絲生長旺盛，但菌落略顯薄，菌絲較稀疏；馬鈴薯一玉米粉培養基菌落較厚，菌絲粗壯，基生菌絲發達，氣生菌絲不發達；PDA培養基菌落較厚，菌絲粗壯，氣生菌絲生長旺盛；馬鈴薯綜合、玉米瓊脂和板栗葉培養基菌絲生長均較慢。

2.2 不同碳源對O.castanea菌絲生長的影響

在8種不同碳源的培養基上，以甘露醇為碳源的培養基上菌絲生長最好，生長快，菌落厚、致密，菌落邊緣濃白，生長旺盛，中部淡黃色；麥芽糖培養基次之。在果糖、木糖培養基上，菌落較厚，菌絲生長旺盛，但菌落邊緣不整齊，部分菌絲易老化變成淡黃色，菌絲短呈絨毛狀，生長緩慢，部分菌落邊沿呈黃棕色；在甘油、淀粉培養基上，菌落白色至淡黃色，略薄，老化現象明顯；在葡萄糖、蔗糖培養基上，菌絲生長最差，菌絲老化嚴重，菌落均較小、薄，菌絲淡黃色短絨毛狀，菌落邊沿黃棕色（圖2）。

2.3 不同氮源對O.castanea菌絲生長的影響

蛋白胨培養基上菌落生長速度快，菌落致密、厚，菌絲白色，生長旺盛，為最適氮源；牛肉浸膏次之。在硝酸鈉培養基上，菌絲生長較快，菌落初期濃白致密，但后期氣生菌絲徒長，菌絲細弱，菌落邊沿薄；在對照、氯化銨、天冬酰胺和甘氨酸培養基上菌落較致密，菌絲白色至淡黃色，菌絲老化明顯，菌落形狀不規則。與對照相比，加入氮源蛋白胨、牛肉浸膏可以促進菌絲生長，而加入氮源氯化銨、天冬酰胺、硝酸鈉、甘氨酸則抑制菌絲生長。以尿素為氮源的培養基中菌絲不生長。

2.4 不同溫度對O.castanea菌絲生長的影響

菌絲在15～28℃的溫度范圍內都能生長，25℃時生長最快，且菌落最厚，菌絲濃密，生長旺盛。28℃以上生長緩慢，5℃和35℃時菌絲不能生長（圖4），表明該菌適宜相對中溫偏低的環境。

2.5 不同pH值對O.castanea菌絲生長的影響

菌絲在pH值5～8的PDA培養基中均能生長，以pH值6生長最好，菌落致密，生長速度最快，菌絲濃白。在pH值為5、7、8的培養基中，菌絲生長較快，菌落略薄，菌絲老化明顯，菌落形狀不規則。當pH值在3以下時，菌絲基本不能生長。pH值為9時，菌絲生長緩慢（圖5）。

3 結論與討論

對菌株O.castanea生物學特性研究結果表明，菌絲在馬鈴薯一板栗葉、馬鈴薯一玉米粉、PDA培養基上生長良好，以馬鈴薯一板栗葉培養基最為合適；適宜碳源為甘露醇和麥芽糖，以甘露醇為最佳；蛋白胨和牛肉浸膏能促進菌絲生長，促進作用最明顯的是蛋白胨。菌絲生長的適宜溫度為15～28℃，最適溫度為25℃。菌絲在pH為4～9的PDA培養基中均能生長，最適pH為6。

自然條件下在夏末秋初O.castanea的菌絲出現在病斑上，此后發生量逐漸增多，直至11月，在這一時期氣溫相對適宜，有利于菌絲生長，這一現象與O.castanea菌絲適宜溫度為15～28℃這一測定結果是一致的。在自然界只能在板栗褐緣葉枯病病斑擴展到一定大小時才能在其病健交界處分離到O.castanea，O.castanea和P.castaneae-mollissimae具有協同侵染的特性。姜淑霞等曾測出板栗褐緣葉枯病病原菌P.castaneae-mollis-simae的適宜溫度范圍為20～30℃，適宜pH范圍為5～6。室內測定，適宜O.castanea菌絲生長的溫度范圍比P.castaneae-mollissimae的低，并且二者最適pH值相同，也證實了兩菌在同一時間內共同生長在同一病斑上的自然現象。

在O.castanea菌絲的生物學特性試驗中，不同處理條件下，培養時間延長后一些菌落會出現白色、黃色兩種菌絲，白色菌絲生長較快，黃色菌絲生長緩慢，甚至不再生長，邊沿黃棕色，兩種菌絲生長速度不一，造成菌落形狀不規則。分析認為，白色菌絲為正常菌絲，菌絲老化后產生淡黃色色素使菌絲發黃并且可以抑制菌絲的生長。