桃上蘋果褪綠葉斑病毒的發生與檢測

王海榮　劉偉　安淼　董曉民　余賢美

摘要：對山東省果樹研究所試驗基地‘玉妃、‘超紅、‘岱妃三個桃品種的蘋果褪綠葉斑病毒病的發生情況進行調查，采集22份樣品，利用ACLSV特異性引物進行RT-PCR檢測。結果表明，在‘玉妃桃的葉片中擴增出與蘋果褪綠葉斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV）預期大小一致的目的片段，并與Gen-Bank登錄的病毒核苷酸序列具有較高的一致性，而在‘超紅和‘岱妃桃中均未檢測到該病毒。

關鍵詞：桃；蘋果褪綠葉斑病毒；病原檢測

中圖分類號：S436.621.1⁺9 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2016）04-0109-03

桃（Prunus persica L.）為薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus）桃亞屬（Amygdalus）多年生中型喬木，在我國有著悠久的栽培歷史。近年來，桃樹栽培面積不斷擴大，以及栽培中苗木引種和調運、無性繁殖代數增多等因素，加快了桃病毒病的傳播和發生，極大地影響了桃樹的經濟價值。蘋果褪綠葉斑病毒（Apple chlorotic leafspot virus，ACLSV）屬于潛隱性病毒，寄主范圍和分布較廣，能侵染多種果樹，在世界各國均有發生。桃感染該病后，葉片上出現深綠光點或波浪狀斑，該癥狀稱為桃深綠光點斑駁，在溫室比大田更為明顯。某些品種感病后會引起不親和現象，如果用李作砧木，在6～8年后出現親和力不強現象，嫁接口壞死樹體衰弱。本研究中筆者對‘玉妃、‘超紅、‘岱妃三個桃新品種進行蘋果褪綠葉斑病毒檢測，為下一步建立無毒桃繁殖體系和培育桃優良品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料 供試3個桃品種（‘玉妃、‘超紅、‘岱妃）于2014年9月取自山東省果樹研究所桃試驗基地（泰安）。每棵樹采集10個枝條作為一個樣品，隨機采集有疑似病毒病和無發病癥狀的幼嫩部位枝條，裝入塑料袋，編號標記后立即放人冰盒，帶回實驗室取葉片作為待測物。其中，‘玉妃桃采集10棵樹，編號分別為YF1～YF10；‘超紅桃采集10棵樹，編號分別為CH1～CH10；‘岱妃桃采集2棵樹，編號分別為DF1、DF2。

1.1.2 主要試劑 TRNzol Reagemt，購自北京天根生化科技有限公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒，購自Axygen試劑公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取 參考用TRIzol法提取桃葉片總RNA，得到的RNA溶液保存于-80℃冰箱中備用。

1.2.2 引物設計 用于檢測蘋果褪綠葉斑病毒的引物序列為ACLSV-F（5-TCTGCAAGAGAATTTCAGTT-3）和ACLSV-R（5-GTCTACAG-GCTATTTATTATAAG-3）。

1.2.3 RT-PCR 反轉錄：在1.5mL離心管中加入RNA模板1μL，2.5mmol/LdNTPs2μL，5×M-MLVbuffer2μL，20μmol/L6-Rad0.5μL，20μmol/LOligo（dT）0.5μL，40U/μLRNaseinhibitor0.5μL，200U/μLM-MLV反轉錄酶0.5μL，加ddH₂O至總體積為10μL。25℃放置10min，42℃放置1h，冰浴2min，-20℃保存備用。

PCR擴增：PCR體系為2×TaqPCRMaster-mix7.5μL，20μmol/LR-primer和20μmol/LF-primer各0.5μL，反轉錄產物1μL，加ddH₂O至總體積為15μL，充分混勻后置于PCR儀中。反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸50s，35個循環；72℃延伸10min。

1.2.4 PCR產物克隆及序列分析 PCR產物的純化、連接、轉化和克隆篩選：按試劑盒操作指南，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒進行擴增產物的純化，分別將純化產物連接至pGEM-T克隆載體，轉化大腸感菌DH5α感受態細胞，篩選單菌落置于1mLLB培養基（含氨芐青霉素）中培養，通過菌液PCR檢測來鑒定重組質粒。

目的片段的序列測定和分析：經菌液PCR，篩選3個陽性菌液送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行序列測定。通過BLAST數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索目的片段的同源序列，并用DNAMAN軟件對蘋果褪綠葉斑病毒的基因片段序列進行分析。

2 結果與分析

以不同品種桃葉片的總RNA反轉錄產物為模板，分別進行RT-PCR擴增，PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，切取目的條帶，經凝膠回收試劑盒回收純化后連接至pGEM-T，克隆測序。結果（圖1）顯示，從‘玉妃桃樣品YF2、YF7、YF10中可擴增得到800bp的特異片段，與預期產物大小相同，與GenBank中已報道的ACLSV分離物的核苷酸序列（登錄號NC001409）一致性為96%，檢出率為13.64%。

3 結論與討論

我國有豐富的桃品種資源，種植廣泛。病毒病的發生一直是影響我國桃產業健康發展的重要原因之一，進行病毒檢測是建立無病毒苗木繁殖的必要條件。本研究對山東省果樹研究所桃試驗基地（泰安）3個桃品種的蘋果褪綠葉斑病毒的發生情況進行調查，經RT-PCR檢測發現：從3株‘玉妃桃（YF2、YF7、YF10）中檢測到該病毒，檢出率為13.64%。

蘋果褪綠葉斑病毒在桃樹上一直有著較高的發病率。阮小鳳等（1998）對陜西省桃主產區病毒病發生情況的調查和檢測結果顯示，ACLSV的發生較普遍，單獨感染率為15.8%，與各種病毒的混合感染都有出現；牛飛慶（2012）從我國12個省的417份桃樹樣品中檢測出ACLSV的帶毒率為20%；于云（2013）從我國12個省的505份桃樹樣品中檢測到ACLSV、櫻桃綠環斑駁病毒（CGRMV）、李屬壞死環斑病毒（PNRSV）、杏假褪綠葉斑病毒（APCLSV），其中ACLSV的感染率最高達71.8%，而且山東省的病毒發生率高達58.3%。總之，不同地區桃樹的病毒病發生情況與繁殖用苗帶毒與否有很大關系，一旦繁殖材料帶毒，就會加快桃樹病毒病的傳播蔓延，所以使用無病毒繁殖材料和選擇抗性強的桃樹品種是預防桃病毒病的重要手段。本試驗只在‘玉妃桃上檢測到ACLSV，表明‘超紅和‘岱妃有著相對強的抗病性。由于本試驗檢測的樣品數量有限，還無法確定該病毒在本地區的分布情況，仍需進一步調查研究。