黑斑蛙胰島素樣生長因子—2原核表達載體構建

劉乙雨+曾從濤+吳金芋+樊汶樵

摘要：胰島素樣生長因子-2（IGF-2）是介導生長激素發揮生物學功能的重要因子，在動物機體的生長發育中具有重要作用。為對黑斑蛙IGF-2基因進行原核表達，本研究針對轉錄組數據中的黑斑蛙IGF-2序列，設計引物擴增IGF-2的完整基因，獲得了全長為944 bp、ORF長為651 bp的序列；隨后在黑斑蛙IGF-2的ORF兩端添加限制性內切酶位點后亞克隆到pET-32a（+）質粒中，構建了黑斑蛙IGF-2的原核表達載體。為獲得黑斑蛙IGF-2的表達產物并探究其生物學作用奠定了基礎。

關鍵詞：黑斑蛙；胰島素樣生長因子-2；表達載體構建

中圖分類號：S855.1 文獻標識碼：B 文章編號：1007-273X（2016）08-0005-02

胰島素樣生長因子-2（insulin -like growth factors Ⅱ，IGF-2），又稱生長調節素A，是一個單鏈多肽分子，與胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factorsⅠ，IGF-1）在氨基酸組成上具有同源性，并且二者都與胰島素原（proinsulin）具有同源性[1]，故此得名。IGF-2是一個在細胞增殖、分化、程序性細胞死亡和轉化中具有重要作用的因子，對個體生長、發育具有重要作用[2]。

黑斑蛙（Rana nigromaculata）俗稱“青蛙”、“田雞”；隸屬于兩棲綱、無尾目、蛙科；是我國分布最廣的兩棲動物之一，也具有較高的商業價值[3]。主要生活于海拔1 000 m以下的平原丘陵地區，多棲息于稻田、菜園、池塘、山溝等地；對環境適應性極強。本研究以黑斑蛙為研究對象，對黑斑蛙IGF-2基因進行克隆并構建原核表達載體，為下一步獲得其表達產物及生物學功能鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

黑斑蛙生長在重慶珍稀瀕危水產資源保護與開發研究中心的流水養殖系統中，挑選健康的成蛙，采用雙毀髓法處死后取其肝臟組織，立即放入液氮中保存。

Trizol購自上海生工，Taq酶、pGEM-T質粒購自Promega公司，高純質粒小量快速提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收及純化試劑盒購自博邁德生物公司，感受態BL21（DE3）購自北京天根生化有限公司，XhoⅠ、BamH I 購自大連寶生物公司，酵母提取物、蛋白胨、Agar購自OXOID公司，pET-32a（+）由本室保存備用。氨芐青霉素50 mg/mL為本室自己保存備用。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據轉錄組數據庫中IGF-2序列的保守區，利用Primer 5.0軟件，設計一對特異性擴增引物（上游引物：5′-GCAACATCCAGC

AATACCACAGACGA-3′，下游引物： 5′-CTTTGGTG

TCTCAGTTTGCTCGTTT-3′）。引物并交由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2.2 cDNA制備 取液氮中保存的黑斑蛙肝臟。根據Trizol試劑盒說明書進行總RNA的提取，并利用Promega公司的cDNA合成試劑盒說明書完成cDNA的制備。

1.2.3 PCR擴增 利用高保真DNA Taq酶進行PCR擴增，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用凝膠回收試劑盒進行回收。陽性產物送蘇州金唯智生物科技有限公司測序。

1.2.4 IGF-2亞克隆引物設計 為了使IGF-2與pET-32a（+）質粒相連，在IGF-2片段上、下游引物分別引入BamH I和Xho I等限制性內切酶的識別位點并設計特異性引物（上游引物：5′-CGCGGATCC

ATGGAGCAACTAAGATGCAAAACCA-3′；下游引物：5′-GGCGAGCTCTCAATTATGGGAGGACTCTGA GTCT-3′）。引物交由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2.5 表達載體的構建 對1.2.3中獲得的IGF-2全基因片段用高保真DNA Taq酶進行PCR擴增。產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用瓊脂糖凝膠回收及純化試劑盒回收，用BamH I和Xho I對擴增的IGF-2片段與pET-32a（+）質粒分別進行雙酶切，酶切產物使用T4DNA連接酶連接并轉化大腸桿菌BL21（DE）。陽性重組子用高純質粒小量快速提取試劑盒提取質粒，并進行雙酶切鑒定；酶切結果送蘇州金唯智生物科技有限公司測序鑒定。

2 結果

2.1 IGF-2全基因序列克隆結果

從黑斑蛙肝臟cDNA中克隆到約950 bp大小的基因片段，與預期產物一致，電泳結果見圖1。該片段包含IGF-2基因全序列，包含651 bp的完整ORF。

2.2 IGF-2原核表達載體構建結果

由圖2可知，提取的陽性重組質粒子經BamH I和Xho I雙酶切后，出現約700 bp和5 900 bp的片段，與預期結果一致。

3 討論

動物GH/IGF軸相關激素的效應對于機體生長發育具有至關重要的作用，其效應模式主要是由多種因子和多種調控模式組成了GH合成與分泌的調控網絡。在該模式中，GH處于上游位置，而IGF 則處于下游位置，直接作用于靶細胞，介導GH 的生物效應[4]。其中，IGF-2的作用主要體現在加快細胞周期進程、調控細胞增殖、增加DNA的合成能力和血管的合成能力[5]。目前已經證明IGF-2與瘦肉率、脂肪積淀等許多經濟性狀有關[6]。近年來IGF-2與多種疾病的關系已經引起了極大關注，相信隨著對其研究的深入，將有助于人類控制自身的疾病，也能為臨床診斷、治療帶來新思路[7]。

目前關于IGF-2的研究多在于哺乳動物，兩棲類IGF-2報道很少，有鑒于此，本實驗以黑斑蛙IGF-2為研究對象，獲得了陽性重組質粒。為下一步探究IGF-2在pET-32a（+）質粒中最優表達條件的篩選、表達產物的生物學活性測定奠定了基礎；也為黑斑蛙IGF-2的臨床應用提供了參考。

參考文獻：

[1] POLLAK M. The insulin and insulin-like growth factor receptor family in neoplasia：an update[J].Nat Rev Cancer，2012，12（3）：159-169.

[2] PERRINI S，LAVIOLA L，CARREIRAM C，et al. The GH/IGFⅠ axis and signaling pathways in the muscle and bone： mechanisms underlying age-related skeletal muscle wasting and osteoporosis[J]. J Endocrinol，2010，205（3）：201-210.

[3] 費 梁，葉昌媛，黃永昭，等.中國兩棲動物檢索及圖解[M].成都：四川科學技術出版社，2005.

[4] CANOSA L F，CHANG J P，PETER R E. Neuroendocrine control of growth hormone in fish[J].Gen Comp Endocr，2007，151（1）：1-26.

[5] 彭鳳蘭.胰島素生長因子2（Igf2）研究進展[J].實用預防醫學， 2007，14（6）：1963-1966.

[6] 王丁科，閻 萍，梁春年，等.胰島素樣生長因子2研究進展[J].動物醫學進展，2008，29（7）：67-70.

[7] 朱 嬋.IGF2的生物學特性及其與疾病關系的研究進展[J].國際檢驗醫學雜志，2010，31（9）：966-969.