脂質相態對高蛋白質中間水分食品穩定性的影響

陸乃彥，張 軒，李 娟，周 鵬

（食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫214122）

脂質相態對高蛋白質中間水分食品穩定性的影響

陸乃彥，張 軒，李 娟，周 鵬*

（食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫214122）

高蛋白質中間水分食品的品質在儲藏過程中會因發生嚴重的劣化而導致其貨架期受到限制，其中脂質導致的相分離是重要原因之一。研究采用乳清分離蛋白質、酪蛋白酸鈉和大豆分離蛋白質為蛋白源，以不同相變溫度的十四酸甲酯（C14）和硬脂酸甲酯（C18）為模型脂質，建立中間水分食品模型體系，通過質構儀、激光共聚焦熒光顯微鏡、低場核磁共振和差示掃描量熱等手段，研究了脂質相態對該體系在儲藏過程中穩定性的影響。結果表明，在儲藏過程中，C14（液態脂）體系的硬度相對C18（固態脂）體系較小，但在該體系中發生了嚴重的相分離情況，而C18體系中蛋白質與脂質通過疏水相互作用而結合，體系變得更為均勻，并且不易發生出油現象。

高蛋白質中間水分食品；脂質相態；蛋白源；儲藏穩定性；硬化

Keywords：high-protein intermediate-moisture foods，lipid phase，protein source，storage stability，hardening

高蛋白質中間水分食品通常指的是一類蛋白質質量分數在15%～45%且水分活度在0.5～0.8的食品（如高蛋白質營養棒），主要含有蛋白質、脂質、碳水化合物以及其他小分子保濕劑和增塑劑［1］。這類食品在加工過程中不需要干燥或加熱，并且其相對較低的水分活度能夠抑制微生物的生長［2］。然而，中間水分食品在儲藏過程中會發生一系列物理化學變化，導致其品質發生嚴重的劣化［3-4］。

在儲藏過程中引起高蛋白質中間水分食品品質發生劣化的機制十分復雜，包括蛋白質聚集［5-6］、美拉德反應［7］、糖結晶［8］、相分離［4，9］和水分遷移［4，9-11］等。高蛋白質營養棒體系中的脂質易與體系中其他成分發生相分離現象，如酪蛋白酸鈣營養棒中的可可脂會逐漸遷移到營養棒的表面［11］；乳清蛋白營養棒在儲藏過程中會發生嚴重的相分離現象，而將其部分水解后，相分離現象會得到抑制［9］。蛋白棒中的相分離會導致其質地發生硬化，并且不同相變溫度的脂質在室溫儲藏條件下所處的相態不同，會對該硬化過程產生不同程度的影響［12］。

在食品體系中，蛋白質與脂質之間的相互作用比較復雜，如在適當的pH值下，蛋白質與磷脂之間會發生靜電相互作用［13］；蛋白質與脂肪酸、甘油單酯等脂質間存在氫鍵相互作用；脂質氧化過程中會與蛋白質間形成共價鍵［14］。在蛋白棒體系中，最常用的脂質包括植物起酥油、可可脂、菜籽油等。疏水相互作用是大多數甘油三酯與蛋白質間最主要的相互作用，對于儲藏過程中脂質在蛋白棒體系中的分布情況有重要影響［13］。研究表明，乳清蛋白營養棒體系中的脂質在儲藏一天后就被從連續相中分離出來，而酪蛋白酸鈣營養棒體系中的脂質則存在于蛋白質顆粒組成的網絡結構的間隙中［11］。

以疏水性不同的3種蛋白質 （乳清蛋白質、酪蛋白酸鈉和大豆蛋白質）為蛋白源，以十四酸甲酯和硬脂酸甲酯為模型脂質（在室溫儲藏條件下分別處于液態相和固態相），建立中間水分食品模型體系，通過激光共聚焦熒光顯微鏡、低場核磁共振和差示掃描量熱等手段，研究脂質相態對高蛋白質中間水分食品體系在儲藏過程中的相分離情況及穩定性的影響，為進一步提高高蛋白質中間水分食品穩定性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

采用3種噴霧干燥后制得的食品蛋白質顆粒。酪蛋白酸鈉（NaCN，質量分數87%）和乳清分離蛋白質（WPI，質量分數90%），購于恒天然乳品集團；大豆分離蛋白質（SPI，質量分數87%），購于南通光合生物技術有限公司；熒光染料FITC，購于Sigma-Aldrich公司；甘油和山梨醇（分析純），購于國藥集團；十四酸甲酯和硬脂酸甲酯，購于阿拉丁試劑公司。

1.2 主要儀器設備

CLSM 710型激光共聚焦顯微鏡，德國Zeiss公司制造；NMI20-Analyst核磁共振分析儀，上海紐邁電子科技股份有限公司制造；TA-XT-plus質構儀，英國Stable Micro Systems公司制造；SHP-250型生化培養箱，上海森信實驗儀器有限公司制造；水分活度密閉容器，美國Decagon公司制造；DSC 214 Polyma示差掃描量熱儀，德國Netzsch公司制造。

1.3 方法

1.3.1 高蛋白質中間水分食品模型體系的制備樣品配方包括4 g蛋白質、1 g脂質、2.25 g山梨醇、1.5 g甘油及1.25 g水（見表1）。首先將山梨醇溶于水中，加入甘油并攪拌均勻。向混合液中加入蛋白質和脂質，初步攪拌后用手揉搓均勻成團，裝進水分活度密閉容器中，并用封口膜密封以防止水分丟失。制備過程在40℃進行，保證使用的脂質處于液態相。將制好的樣品置于25℃生化培養箱中貯藏，每個模型體系制備3個平行樣品。樣品中使用的蛋白質分別為WPI、NaCN和SPI，脂質分別為十四酸甲酯和硬脂酸甲酯，不同原料制得的樣品分別標記為 WPI-C14、WPI-C18、NaCN-C14、NaCN-C18、SPIC14和SPI-C18。

1.3.2 體系硬度變化的測定 用質構儀檢測貯藏過程中模型體系的硬度變化，選取的時間分別為0、1、3、7、14 d。選取直徑為2 mm的圓柱形P/2探頭進行穿刺實驗，下壓速度為 1.0 mm/s，觸發應力為5 g，下壓程度為50%。通過穿刺過程中得到的最大應力表示為模型體系的硬度，每次測量做3次并取平均值。

表1 高蛋白質中間水分食品模型體系配方Table 1 Formula of high-protein intermediate-moisture food model systems

1.3.3 體系微觀結構變化的測定 用激光共聚焦熒光顯微鏡檢測模型體系在貯藏過程中微觀結構的變化，時間分別為0、1、3、14 d，其中蛋白質用熒光染料FITC標記，脂質用熒光染料尼羅紅標記［15］。將染色劑FITC溶于丙酮中配成20 μg/mL的FITC染色液。將染色劑尼羅紅溶于丙酮中配20 μg/mL的尼羅紅染色液。取1 g新鮮樣品，滴加12 μL FITC染色液和20 μL尼羅紅染色液并攪拌，取適量樣品（約0.3 g）置于玻底培養皿中，密封后在25℃下避光保存。觀察時，將樣品置于載物臺上，20倍物鏡下通過兩個熒光通道進行觀測，其中FITC激發波長為488 nm，尼羅紅激發波長為552 nm。使用儀器自帶軟件Zen 2011（德國Zeiss公司）進行圖像拍攝。

1.3.4 體系橫向弛豫時間T2變化的測定 用核磁共振分析儀檢測模型體系在貯藏過程中氫原子橫向弛豫時間（T2）的變化（0、1、3、14 d），從而進一步反映模型體系中脂質的流動性變化。取適量樣品（約0.5 g）并用聚四氟乙烯包裹，將其放入核磁管中并放進設備，用硬脈沖序列調節中心頻率進行多脈沖回波序列掃描，每次測量重復3遍；采樣點數94 220，回波個數2 048，重復掃描次數64，弛豫衰減時間1 s。通過MultiExp InvAnalysis軟件對測得結果進行反演，得到模型體系橫向弛豫時間T2的連續分布圖。

1.3.5 示差掃描量熱儀測定熱流 使用DSC 214 Polyma示差掃描量熱儀測定樣品升溫過程中的熱流變化。分別使用純水和銦為參照校正溫度和熱流。樣品測定時先以-20℃/min冷卻至5℃，在5℃平衡3 min，再以5℃/min升溫至95℃。通過檢測升溫過程中熱流（mW/mg）的變化，反映樣品中脂質的相變情況。每個體系做3個平行。

2 結果與討論

2.1 模型體系的硬度變化

貯藏過程中模型體系的硬度變化趨勢如圖1所示。所有模型體系在儲藏過程中其硬度隨時間上升，其中WPI體系質地最為柔軟，而NaCN體系硬度最大，與作者的前期研究結果一致［10］。NaCN和SPI體系的硬度變化趨勢相似，在第一個星期的儲藏過程中硬度迅速上升，隨后硬化速度逐漸變慢，而WPI體系在儲藏過程中硬化速度基本保持不變，并且最終的硬度遠遠小于NaCN和SPI體系。另外，對于相同的蛋白質體系，加入固態C18甲酯樣品的硬度大于加入液態C14甲酯樣品的硬度。

圖1 不同模型體系在儲藏過程中（25℃）的硬度變化Fig.1 Hardness changes of model systems made with different types of protein powders and methyl esters during storage at 25℃

2.2 模型體系的微觀結構變化

模型體系在儲藏過程中微觀結構的變化如圖2、圖3所示，其中紅色部分為尼羅紅標記的脂質，綠色部分為FITC標記的蛋白質。對于WPI-C14體系，從儲藏的初始狀態就可以觀測到明顯的相分離現象。連續相中的主要成分包括蛋白質和水分等小分子，脂質則存在于空隙中。在儲藏過程中，空隙中的脂質互相融合，逐漸從微觀相分離過度到介觀相分離。然而，對于WPI-C18體系，其微觀結構的變化趨勢則相反。在儲藏的初始狀態，體系中同樣能夠觀測到脂質小球，但是由于C18脂質在25℃下處于固態相，流動性較差，這些脂質無法進一步融合，反而通過與蛋白質之間的疏水相互作用進入到連續相中（圖中黃色部分），脂質與連續相的界限逐漸變模糊。NaCN體系中脂質分布情況的變化趨勢與WPI體系類似。在NaCN-C14體系中，在儲藏初始階段就可以觀察到相分離現象。脂質小滴在儲藏過程中逐漸融合并形成較大的脂質區域（圖2中紅色部分）。由于NaCN的疏水性相對WPI較強，在圖像中可以觀察到由于脂質與蛋白質間的疏水相互作用，導致部分區域兩者的重疊。然而，由于C14脂質在儲藏過程中的融合，導致其比表面積較小，蛋白質與脂質相互作用而融合的程度遠遠低于C18體系。

圖2 C14模型體系在儲藏過程中的微觀結構變化Fig.2 Microstructure of C14 methyl ester added model systems observed by CLSM

SPI的疏水性最強［16］，其無法在樣品制備過程中被完全溶解，在體系中仍然保持顆粒狀態，并且脂質與其之間的疏水相互作用明顯比另外兩個體系更強。如圖中所示，C14甲酯包裹于SPI顆粒表面，并且在儲藏過程中逐漸進入到顆粒內部，但在14 d后依然有較多脂質未與蛋白質結合。SPI-C18體系觀察到的現象與此類似，但脂質在3 d內就基本完全進入到連續相中，這也是SPI-C18體系的硬度在3 d后基本保持不變的原因（見上圖1）。

為了進一步驗證脂質相態對模型體系儲藏穩定性的影響，將NaCN-C18體系置于45℃恒溫培養箱中儲藏14 d，其在儲藏后的微觀結構如圖4所示（25℃下觀察）。在該儲藏溫度下，硬脂酸甲酯處于液態相。從圖可見，絕大多數的C18脂質依然存在于蛋白網絡結構的孔隙中，其相分離狀態與25℃下儲藏的C14脂質（液態相）相近。以上結果對比表明，25℃下儲藏的C14體系和C18體系中脂質分布情況的差異是由脂質的相態不同所致。

另外，當體系中加入不同相變溫度的脂質，其相分離情況的區別同樣對其在儲藏過程中外觀性質的變化有重要影響。對于WPI-C14和NaCN-C14體系，由于其相分離程度更高，脂質從連續相中排出，導致體系表面在儲藏過程中出油變黏，進一步降低其品質。而對于相應的C18體系，樣品的表面性質則不會因此而劣化。

圖3 C18模型體系在儲藏過程中的微觀結構變化Fig.3 Microstructure of C18 methyl ester added model systems observed by CLSM

圖4 NaCN-C18體系在45℃儲藏14 d后的微觀結構（25℃觀測）Fig.4 Microstructure of NaCN-C18 model system stored at 45℃for 14 d，observed at 25℃by CLSM

2.3 體系中脂質分子流動性的變化

采用橫向弛豫時間（T2）的分布情況來反映體系中脂質和水分等小分子的流動性，T2值越大，則說明分子的流動性越強。對于同一個樣品來說，特定橫向弛豫時間的信號強度代表處于相應狀態的分子的含量。由于鄰近的水分子和其他親水化合物間氫鍵的存在，自由狀態下水、甘油和山梨醇等小分子的橫向弛豫時間遠遠小于脂質的橫向弛豫時間［17］。如圖5所示，處于自由狀態脂質的T2值大于100 ms，其余相對較小的T2值則對應水、甘油和山梨醇等小分子［10］。對于WPI-C18體系，對應自由脂質T2值（＞100 ms）的信號峰在儲藏過程中迅速變小，并在1 d后消失，表明其與蛋白質間發生相互作用，從而導致流動性下降。而對于WPI-C14體系來說，對應自由脂質的信號峰強度在儲藏過程中幾乎保持不變，表明絕大多數脂質依然處于自由狀態，未與蛋白質結合。NaCN和SPI體系中脂質對應的橫向弛豫時間的變化趨勢與WPI體系相似，進一步表明C18體系中脂質與蛋白質相互作用更強，限制了脂質分子的流動性。

2.4 體系中脂質相變溫度的變化

采用示差掃描量熱儀進一步研究模型體系中脂質相態的影響，其結果如圖6所示。從圖可見，當加入到模型體系中后，C14和C18脂質的相變溫度略為升高，相變峰變寬，并且在儲藏過程中進一步升高。此現象可能是由于疏水相互作用誘導的蛋白質和脂質結合所致。在所應用的3種蛋白質中，SPI疏水性最強，WPI疏水性最弱，而相變溫度升高的程度也與此相對應。

圖5 脂肪酸甲酯的核磁共振結果及模型體系在儲藏過程中的T2橫向弛豫時間變化Fig.5 NMR results of pure methyl esters and changes in T2relaxation time distribution of the model systems during storage

從以上結果可以看出，在模型體系儲藏過程中同時存在兩個互相拮抗的作用：一方面，由于表面能較大，脂質小滴在儲藏過程中趨向于互相融合，從而導致體系發生相分離［18］；另一方面，脂質小滴與蛋白質之間的疏水相互作用促使脂質分子進入到連續相中。對于C18體系來說，由于固態相的脂質流動性相對較差，減弱了第一個方面的作用，并且未融合的脂質小滴具有更大的比表面積，進一步促進了其與蛋白質間的相互作用，即增強了第二個方面的作用。在這兩方面的作用下，最終體系中的脂質處于兩個不同的狀態：自由存在于脂質小滴中以及通過疏水相互作用與蛋白質結合［12］，這與體系的相變峰變寬是一致的。

圖6 模型體系在儲藏過程中的DSC曲線Fig.6 DSC curves of the model systems during storage

3 結語

以WPI、NaCN和SPI為蛋白源，十四酸甲酯和硬脂酸甲酯為模型脂質，研究了脂質相態對高蛋白質中間水分食品儲藏穩定性的影響。研究結果表明，當體系中的脂質處于液態相時，脂質與連續相（包括蛋白質、水分、山梨醇和甘油等）在儲藏過程中發生相分離；而當體系中的脂質處于固態相時，體系的相分離受到阻遏，脂質分子在儲藏過程中逐漸進入到連續相中。另外，對于同一種蛋白質，含有固態脂體系的硬度較含有液態脂體系的硬度要大，然而含有固態脂的體系更為均一，不會產生出油現象。

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Effect of Lipid Phase State on the Storage Stability of High-Protein Intermediate-Moisture Foods

LU Naiyan，ZHANG Xuan，LI Juan，ZHOU Peng*
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

High-protein intermediate-moisture foods suffered from serious deterioration of quality during storage restricts the shelf life of this type of food.Phase separation between lipids and other compounds is known as one of the most important factors.Two types of lipids with different phases，methyl myristate（C14 methyl ester）in liquid form and methyl stearate（C18 methyl ester）in solid form，were added to high-protein intermediate-moisture food model systems made with whey protein isolate，sodium caseinate or soy protein isolate.Textureanalyzer，confocallaserscanning microscope，low-field nuclear magnetic resonance，and differential scanning calorimeter were used to investigate the influence of lipid phase states on the system stability during storage.It was found that systems with solid lipids were harder than those with liquid lipids during storage.However，the latter system suffered from phase separation，while the C18 systems became more homogeneous as the storage progressed，and without oil exudation was found.

TS 252.4

A

1673—1689（2016）010—1020—08

2016-04-08

國家自然科學基金項目 （31471697，31071492）；教育部科學技術研究項目 （113032A）；高等學校學科創新引智計劃（111 Project-B07029）；食品科學與技術國家重點實驗室自由探索課題（SKLF-ZZA-201507）。

陸乃彥（1985—），男，江蘇無錫人，理學博士，副教授，主要從事食品蛋白質和脂質方面的研究。E-mail：lunaiyan@jiangnan.edu.cn

*通信作者：周 鵬（1975—），男，山東青島人，工學博士，教授，主要從事食品物性、乳制品與水產品加工方面的研究。E-mail：zhoupeng@jiangnan.edu.cn