殼聚糖修飾的L-天門冬酰胺酶脂質體的穩定性

萬勝利，何 丹，晏子俊，張嚴方，張景勍

（重慶醫科大學高校藥物工程研究中心，重慶400016）

殼聚糖修飾的L-天門冬酰胺酶脂質體的穩定性

萬勝利，何 丹，晏子俊，張嚴方，張景勍*

（重慶醫科大學高校藥物工程研究中心，重慶400016）

考察殼聚糖修飾的L-天門冬酰胺酶脂質體在體外的穩定性。分別從最適pH、最適溫度、儲存穩定性、酸堿穩定性、熱穩定性，以及抗胰蛋白酶水解的能力等方面，對比游離L-天門冬酰胺酶及殼聚糖修飾的L-天門冬酰胺酶脂質體。結果表明：游離L-天門冬酰胺酶和殼聚糖修飾的L-天門冬酰胺酶脂質體的最適pH分別為7.5和7.0，最適溫度分別為60℃和50℃，殼聚糖修飾的L-天門冬酰胺酶脂質體的儲存穩定性、酸堿穩定性、熱穩定性，以及抗胰蛋白酶水解的能力均優于游離酶。因此，殼聚糖修飾的L-天門冬酰胺酶脂質體能明顯提高游離酶的穩定性。

L-天門冬酰胺酶；脂質體；殼聚糖；穩定性

L-天門冬酰胺酶（L-asparaginase，L-ASP）是一種大分子蛋白質類生化藥物，能將腫瘤細胞生長所需要的L-天冬酰胺水解為氨和L-天冬氨酸，從而有效地抑制腫瘤細胞的生長［1］。L-ASP對急性淋巴細胞白血病及非何杰淋巴瘤有較好的療效，是一種重要的治療白血病的藥物。但L-ASP穩定性差，易被蛋白酶分解等缺點限制了L-ASP的應用［2］。脂質體是一種新型的藥物載體，具有類生物膜的雙分子層結構，可提高被包封藥物的穩定性，現已廣泛應用到抗癌藥物、蛋白多肽類中［3］。殼聚糖是一種高分子天然多糖，具有易化學修飾性和獨特分子結構，對脂質體表面進行修飾的同時，能提高其穩定性［4］。

本研究首次將L-ASP制備成殼聚糖修飾的LASP脂質體 （Chitosan modified liposomes containing L-asparaginase，LACL），以期提供增強酶類穩定性的方法，對L-ASP有重要意義，同時也為其他酶類穩定性的研究奠定了科學理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 主要材料、試劑 L-ASP，以色列Prospec公司產品；殼聚糖，浙江金殼生物化學有限公司產品；卵磷脂，德國Lipoid公司產品；膽固醇，美國Sigma公司產品；L-天門冬酰胺，美國Sigma公司產品；奈斯勒指示劑，作者所在實驗室自制。

1.1.2 主要儀器 KQ 2200 B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司制造；RE-52AA旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠制造；pH計，上海精密科學儀器有限公司制造；85-2型恒溫磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司制造；UV-7504 PC紫外分光光度計，上海欣茂儀器有限公司制造。

1.2 試驗方法

1.2.1 LACL的制備 采用逆向蒸發法制備L-ASP脂質體，取處方量的卵磷脂、膽固醇溶于二氯甲烷中，旋轉蒸發至形成均勻透明薄膜，加入乙醚和10 mL含L-ASP的緩沖液，超聲處理后繼續分散得L-ASP脂質體；將L-ASP脂質體滴加到一定濃度的殼聚糖溶液中，攪拌3 h后4℃靜置12 h即得LACL［5-6］。

1.2.2 L-ASP活性的測定 在50 mmol/L Tris-HCL的緩沖液中（pH7.3），以L-天門冬酰胺為底物，加入0.1 mL L-ASP，于37℃水浴中保溫10 min，加0.1 mL三氯醋酸溶液，終止反應。離心后，取0.5 mL上清液滴入7.0 mL蒸餾水中，再加1.0 mL奈斯勒指示劑，放置10 min后，在480 nm處比色測定生成的氨。酶的活性單位定義：每分鐘催化L-天門冬酰胺水解釋放1 μmol氨所需的酶量［7-8］。

1.2.3 L-ASP和LACL最適pH的選擇 在pH為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5及9.0的條件下，分別測定L-ASP及LACL的活性。以L-ASP在最適pH下的活性為100%，計算其余各點的相對活性。

1.2.4 L-ASP和LACL最適溫度的選擇 在溫度為20、30、40、50、60、70℃的環境下，分別測定L-ASP及LACL的活性。以L-ASP在最適溫度下的活性為100%，計算其余各點樣品的相對活性。

1.2.5 L-ASP和LACL儲存穩定性的考察 L-ASP和LACL在4℃下避光密封貯存，分別于0、1、2、5、10、15、20、28 d測定其活性，結果以活性保留百分率進行計算。

1.2.6 L-ASP和LACL酸堿穩定性的考察 取適量L-ASP和LACL，分別在pH為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5及9.0的一系列緩沖液中孵育40 min，測定其活性。以LACL在pH 7.5時的酸堿穩定性結果為100%，計算其余各點樣品的相對活性。

1.2.7 L-ASP和LACL熱穩定性的考察 將L-ASP和LACL置于55℃的水浴中，分別于0、1、2、3、4 h測定其活性，結果以活性保留百分率進行計算。

1.2.8 L-ASP和LACL抗胰蛋白酶水解能力 取適量L-ASP和LACL，分別加入適量質量濃度為0.1 mg/mL的胰蛋白酶液，混合均勻后，放置于37℃的水浴中，在60 min內測定其活性，結果以活性保留百分率進行計算。

2 結果與討論

2.1 L-ASP和LACL的最適pH

測定結果見圖1，L-ASP和LACL的最適pH分別為7.5和7.0。pH 6～8時，LACL的活性都高于LASP，當L-ASP和LACL都在最適pH時，LACL的活性約為L-ASP的1.4倍，在pH7.5（約等于血漿的生理pH 7.4）時，LACL的活性也明顯高于L-ASP。

圖1 L-ASP和LACL最適pH（n=3）Fig.1 Optimum pH of L-ASP and LACL（n=3）

2.2 L-ASP和LACL的最適溫度

測定結果見圖2，L-ASP的最適溫度為60℃，LACL的最適溫度為50℃，更接近人體體溫，在30～60℃時，LACL的活性明顯高于L-ASP。

2.3 L-ASP和LACL的儲存穩定性

測定結果見圖3，大約在18 d時，L-ASP的活性降至50%，而此時，LACL仍存約有80%的活性；在28 d時，L-ASP僅保留有33.10%的活性，LACL仍保留有61.18%的活性。結果顯示，LACL的儲存穩定性明顯優于L-ASP。

圖2 L-ASP和LACL最適溫度（n=3）Fig.2 Optimum temperature of L-ASP and LACL（n=3）

圖3 L-ASP和LACL的儲存穩定性（n=3）Fig.3 Storage stabilities of L-ASP and LACL（n=3）

2.4 L-ASP和LACL的酸堿穩定性

在pH 6.0～9.0時，LACL的活性保留值均高于L-ASP，見圖4，LACL的酸堿穩定性優于L-ASP。在pH 6.5～8.5時，LACL保留有90%以上的活性；在pH 7.5時，LACL和L-ASP都保留有最大活性，但此時LACL的活性保留值明顯比L-ASP高。結果表明，LACL有更好的抗外界環境酸堿變化的能力。

圖4 L-ASP和LACL的酸堿穩定性（n=3）Fig.4 pH stabilities of L-ASP and LACL（n=3）

2.5 L-ASP和LACL的熱穩定性

L-ASP在3 h時，活性消失，而此時LACL仍保留有約60%的活性，見圖5，結果表明LACL的熱穩定性比L-ASP好。

圖5 55℃條件下L-ASP和LACL的穩定性（n=3）Fig.5 Stability of L-ASPand LACL incubated at 55℃（n=3）

2.6 L-ASP和LACL抗胰蛋白酶水解的能力

L-ASP在有胰蛋白酶的環境中，活性快速下降，30 min時活性降至約50%，此時LACL仍保留有約70%的活性；50 min時，L-ASP的活性消失，此時LACL仍保留有約53%的活性。見圖6，結果顯示，LACL比L-ASP有更好的抗胰蛋白酶水解的能力。

圖6 L-ASP和LACL抗胰蛋白酶水解的能力（n=3）Fig.6 Proteolytic stabilities of L-ASP and LACL（n=3）

3 結語

L-ASP作為一種酶蛋白質藥物，其不穩定性和易被蛋白酶降解等缺點，在一定程度上限制了其被廣泛應用［2，9］。殼聚糖是自然界中一種帶正電的陽離子多糖，具有無毒性和良好的生物相容性，對生物分子、有機物及許多離子有很好的螯合、吸附和離子交換能力［4，6］。本研究中首次將 L-ASP制備成LACL，LACL的穩定性較游離的L-ASP有明顯提高。無論是4℃的儲存條件下，還是55℃的加熱環境下，LACL都能保持較好的活性。結果表明，LACL與L-ASP比較，LACL有更好的抗外界溫度變化的能力。在pH 6.0～9.0時，LACL的活性保留值均高于L-ASP，LCAL較L-ASP有更好的抗外界酸堿變化的能力。游離的L-ASP易被胰蛋白酶水解，半衰期短，而LCAL則表現出良好的抗胰蛋白酶水解的能力。LACL優越的穩定性可能是殼聚糖脂質體對酶起保護作用的結果［10-11］。L-ASP的最適溫度為60℃，而LACL的最適溫度為50℃，更接近人體體溫；在40℃（接近人體體溫）時LACL的活性約為L-ASP的1.1倍。pH6.0～8.0時，LACL的活性高于L-ASP；當L-ASP和LACL都在最適pH下時，LACL的活性約為L-ASP的1.4倍。結果表明，將L-ASP制備成LACL可在一定程度上提高L-ASP的活性，這可能是酶和脂質體膜及殼聚糖相互作用的結果［5，10-11］。

本研究結果顯示，LACL有提高游離酶活性，增強其穩定性的優點，為蛋白酶類藥物的深入研究提供了理論依據。

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Preliminary Study on the Stability of Chitosan-Modified Liposomes Containing L-Asparaginase

WAN Shengli，HE Dan，YAN Zijun，ZHANG Yanfang， ZHANG Jingqing*
（Engineering Research Center in University，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

To investigate the in vitro stability of chitosan-modified liposomes containing L-asparaginase（LACL），the optimal pH，temperature，storage stability，pH stability，thermal stability and proteolytic stability were investigated in this study.The optimal pH values of L-ASP and LACL were at 7.5 and 7.0，respectively.The optimal temperatures of L-ASP and LACL were at 60℃and 50℃，respectively.The stabilities of LACL were higher than that of L-ASP.The results shown that the stability of L-ASP was significantly enhanced by the LACL.

L-asparaginase，liposome，chitosan，stability

Q 556，R 392-33

A

1673—1689（2016）08—1041—04

2015-03-07

國家自然科學基金項目（30973645）。

*通信作者：張景勍（1973—），女，上海人，理學博士，教授，博士研究生導師，主要從事新藥研究與開發。E-mail：zjqrae01@163.com