慢病毒載體PLKO.1-shp65的構建及在乳腺癌細胞MDA-MB-231中功能的研究

黃環靜

（天津醫科大學腫瘤醫院腫瘤研究所，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，乳腺癌防治教育部重點實驗室，天津300060）

慢病毒載體PLKO.1-shp65的構建及在乳腺癌細胞MDA-MB-231中功能的研究

黃環靜

（天津醫科大學腫瘤醫院腫瘤研究所，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，乳腺癌防治教育部重點實驗室，天津300060）

目的：構建p65降表達質粒并包裝成慢病毒，檢測對MDA-MB-231細胞增殖轉移能力的影響。方法：將體外合成的p65干擾片段與PLKO.1-puro連接形成重組慢病毒質粒PLKO.1-shp65，在293FT細胞中進行包裝，產生重組慢病毒顆粒，感染MDA-MB-231細胞。實時定量聚合酶鏈反應（PR-QPCR）、Western blot檢測細胞中p65表達情況。采用細胞計數的方法檢測穩定降表達p65之后對細胞增殖能力的影響，用transwell實驗檢測細胞遷移侵襲能力的變化。用RT-QPCR、Western blot檢測增殖轉移相關基因細胞周期蛋白E1（CCNE1）、細胞周期蛋白D1（CCND1）、細胞周期蛋白B1（CCNB1）、周期蛋白依賴性激酶（CDK1）、細胞分裂周期蛋白7（CDC7）、細胞分裂周期相關蛋白7（CDCA7）表達量的變化。結果：用重組慢病毒顆粒PLKO. 1-shp65感染MDA-MB-231細胞，p65的表達量顯著降低，并且MDA-MB-231細胞的增殖以及遷移侵襲能力降低。同時增殖相關基因CCNE1和CCND1，轉移相關基因Snail、Slug的表達量降低。結論：干擾p65之后MDA-MB-231細胞的增殖、轉移能力降低。

乳腺癌細胞；p65；增殖；轉移

乳腺癌是全球女性中發病率最高的惡性腫瘤，嚴重威脅女性健康［1］。乳腺癌術后易復發，易發生遠處轉移，并且易產生耐藥性以及化療耐受，在我國乳腺癌的發生發展呈現一定的特殊性［2］，因此探究乳腺癌發生發展機制對于治療有很重要的意義。研究表明在乳腺癌的發生發展過程中伴隨著NF-κB信號通路的激活［3］，其能調節多種增殖、轉移相關的基因，從而影響腫瘤的發生發展［4］。p65作為NF-κB信號通路的關鍵轉錄因子，在NF-κB信號通路行使功能過程中起到至關重要的作用。NF-κB信號通路激活過程伴隨著p65入核，從而實現對靶基因的調控，干擾p65之后，NF-κB信號通路不能被激活，失去對下游基因的調控作用。為探究NF-κB信號通路在乳腺癌發生發展過程的作用，我們構建了p65的降表達重組質粒，將其包裝成穩定干擾p65的慢病毒，感染MDA-MB-231細胞。檢測對MDA-MB-231細胞生物學行為的影響，并探究相關機制。

1　材料方法

1.2方法

1.2.1細胞培養用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養MDA-MB-231細胞，置于在37℃，5% CO2的條件下。對數期細胞用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2質粒的構建及鑒定酶切體系：PLKO.1-puro 10-15 μg，Age1 1 μL，Econ R 1 1 μL，10×GreenBuffer 5 μL，無核酸水補齊至50 μL，37℃，4 h進行酶切。酶切后用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產物（未做酶切的PLKO.1載體做對照）。根據膠回收試劑盒說明，進行切膠回收，純化，測定DNA濃度。

連接體系：PLKO.1-puro膠回收產物50 ng，T4連接酶1 μL，T4 Buffer 5 μL，PCR產物2 μL，無核酸水補齊至50 μL。反應溫度為室溫4 h。將連接產物進行轉化，在大腸桿菌感受態細胞中進行擴增，再用質粒提取試劑盒提取質粒。并用Bam H I、Eco RI進行酶切驗證，酶切體系：小提后的DNA 2 μL，Bam H I、Eco R I各0.2 μL，10×GreenBuffer 1 μL，無核酸水補齊至10 μL。1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3慢病毒載體的包裝將6×105個293FT細胞接種于6孔板，第2天進行轉染，轉染體系：PLKO.1 -p65 shRNA 2 μg，psPAX2 1.5 μg，psVSVG 0.5 μg，Lipofectamine 2000 10 μL。6 h后更換新鮮培養基。轉染48 h后發現細胞培養基顏色變成黃色，收集293FT培養上清，1 500 r/min 4℃離心10 min，收集病毒顆粒，用0.45 μm濾膜過濾掉細胞碎片，將病毒置于-80℃保存。

1.2.4慢病毒感染細胞將MDA-MB-231接種于6孔板，待細胞長到70%～80%的飽和度，用慢病毒感染。病毒與培養基按照1：1的體積比加入到6孔板中，感染12 h后更換新鮮培養基。感染72 h后進行puromycin抗性篩選（2 μg/mL），一般藥篩兩周后細胞可用來做后續實驗。

1.2.5細胞的遷移侵襲實驗將處于對數期的穩定干擾p65的MDA-MB-231細胞，用胰蛋白酶消化，無血清培養基重懸，調整細胞濃度為4×104/mL，將500 μL細胞懸液接種到遷移侵襲小室上室中，下室中加入750 μL含20%胎牛血清的培養基（侵襲小室使用前要置于37℃水化2 h）。12 h和24 h后分別取出遷移和侵襲小室，4%多聚甲醛固定20 min，吉姆薩染色20 min，顯微鏡下觀察。

1.2.6細胞計數實驗將處于對數期的穩定干擾p65的MDA-MB-231細胞（1×104）接種于24孔板，每天將細胞用胰蛋白酶消化，重懸之后，用血細胞計數板計數法檢測細胞的增殖情況。

列車旅行時間是指列車從始發站開始出發到從終點站退出運行的所有時間之和,過長的旅行時間則預示線路中可能發生延誤現象[10]。在日常管理中，允許實際旅行時間與規定運行時間存在很小的誤差。設列車在線路中的停站時間為D=[D1,D2,…,Di,…,DN](N為車站總數)，列車在每個區間的運行時間為t=[t1，2,t2，3,…,t(N-1)，N]，則得到列車運行的旅行時間目標為：

1.2.7 RT-QPCR將處于對數期的穩定干擾p65的MDA-MB-231細胞，用PBS輕輕沖洗兩次，吸干殘留PBS，加入500 μL Trizol裂解液，室溫放置20 min，提取總RNA，并反轉成CDNA。40 ng的CDNA用來做RT-QPCR。PCR反應體系為20 μL，反應條件為50℃2 min，95℃3 min，95℃30 s，62℃1 min，40個循環。以GAPDH的mRNA表達量作為內參，標準化靶基因的表達。所用到的引物：GAPDH，上游引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物5′-GAAGATGG TGATGGGATTTC-3′，探針5′（FAM）-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-（TAMRA）3′；p65，上游引物5′-TGCAGAAAGACATTGAGGT-3′，下游引物5′-TCTCCTCAATCCGGTGACGAT-3′；Twist1，上游引物5′ACTTCCTCTACCA GGTCCTC CAG3′，下游引物5′-CCTCCATCCTCCAGACCGAG AA-3′，探針5′（FAM）-TGTGGCTCACGAGCGGCTCA GCTAC-（TAMRA）3′；Snail，上游引物5′-AGCCTGGGTGCCCTCAAGAT-3′，下游引物5′-AGGTTGGAGCGGTC AG CGAA-3′，探針5′（FAM）-TGTCCGGACCCACACTGGCGAGAAG-（TAMRA）3′；Slug，上游引物5′-TGCCTGTCATACCACAACCAGA-3′，下游引物5′-GGAGGAGGTGTCAGATGGAGGA-3′，探針5′（FAM）-ATCACTGTGTG GACTACC GCTGCTC-（TAMRA）3′。2-△CT為該樣本中待測基因相對GAPDH的mRNA的表達量，其中各樣本待測基因的CT值與GAPDH的CT值的差即△CT。

1.2.8 Western blot將處于對數期的穩定干擾p65的MDA-MB-231細胞，用PBS輕輕沖洗兩次，吸干殘留PBS，加入120μL蛋白裂解液。冰上孵育30 min，于4℃，12 000 r/min離心20 min，收集上清。測蛋白濃度，100℃加熱變性。

每孔蛋白上樣量為40 μg，SDS-PAGE變性電泳之后，轉至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h，4℃孵育一抗過夜，TBST洗膜，3次，每次5 min。室溫條件下孵育二抗45 min，TBST洗膜，5次，每次10 min，ECL化學發光試劑顯色1～2 min，X膠片曝光檢測蛋白表達量變化情況。

1.3數據分析臨床病例資料來自TCGA數據庫，用SPSS 17.0軟件進行配對t檢驗差異分析。其他數據用t檢驗進行差異分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1 p65在乳腺癌以及癌旁正常組織中的表達量分析用22對乳腺癌患者的臨床病例，分析癌組織以及癌旁正常組織中p65的表達量差異，發現p65在癌組織中的表達量明顯高于癌旁正常組織（P＜0.05），見圖1。

圖1　乳腺癌組織中p65的表達量顯著高于癌旁正常組織Fig 1 p65 expression ishigher in thetum or than in thetumor-ad jacent norm altissue

2.2重組質粒的酶切鑒定對構建的p65降表達重組質粒進行驗證。由于插入載體的外源片段較小，若用Age I、Econ R I切割連接產物，會將插入片段切開，但是不能在瓊脂糖凝膠電泳中檢測出來，所以我們在插入片段的同時將Eco R I酶切位點破壞。連接產物用Bam H I、Eco R I進行酶切，空載體作為對照。瓊脂糖凝膠電泳檢測，由于成功插入外源片段的質粒中Eco R I的酶切位點被破壞，連接產物酶切后只有1條帶出現在7 000左右，如圖2的第3、4列。未能成功拆入外源DNA片段的載體Eco R I酶切位點未被破壞，雙酶切后有2條帶，分別出現在1 000 bp和6 000 bp左右，說明載體與片段成功連接，如圖2第2列。

2.3病毒干擾效率的檢測檢測病毒感染后的MDA-MB-231細胞中p65表達量的變化，發現在PLKO.1-puro shp65慢病毒感染組中p65的表達量明顯低于對照組，說明篩選之后的細胞中p65穩定降表達。見圖3。

圖2　重組質粒的酶切鑒定Fig 2 Result of enzyme digestion of recom binant plasm ids

圖3　慢病毒感染MDA-MB-231細胞后，鑒定p65蛋白的表達水平Fig 3 p LKO.1-puro shp65 infected MDA-MB-231 cells，westernblot detected the expression of p65

2.4 PLKO.1-puro shp65病毒感染MDA-MB-231細胞，影響細胞形態和細胞增殖能力顯微鏡下觀察，發現慢病毒感染后的MDA-MB-231細胞變得短小并且細胞的增殖能力顯著降低，見圖4。

圖4　慢病毒感染MDA-MB-231細胞，觀察細胞形態以及細胞的增殖能力變化Fig 4 pLKO.1-puro shp65 in fected MDA-MB-231 cells，and observed cell m orphological changes and proliferation ability

2.5穩定降表達p65影響增殖相關基因的表達本文檢測了p65降表達對細胞增殖相關基因表達量的影響，發現CDK1、CCNB1、CDC7、CDCA7的表達量沒有明顯變化，CCNE1和CCND1的表達量明顯降低，見圖5。

圖5　慢病毒感染MDA-MB-231細胞后，檢測增殖相關基因的表達量變化Fig 5 pLKO.1-puro shp65 infected MDA-MB-231 cells and the exp ression of proliferation related genes

2.6 PLKO.1-puro shp65病毒感染MDA-MB-231細胞，其遷移侵襲能力改變藥篩后的細胞進行transwell遷移侵襲實驗，發現穩定降表達p65的細胞遷移侵襲能力顯著降低，見圖6。

圖6　慢病毒感染MDA-MB-231細胞后，Transwell實驗檢測細胞的遷移侵襲能力Fig 6 p LKO.1-puro shp65 infected MDA-MB-231 cells，Transwell detected the metastasis ability of MDA-MB-231 cells

2.7 PLKO.1-puro shp65慢病毒感染MDA-MB-231細胞，影響轉移相關基因的表達本文檢測了上皮間質轉化（EMT）相關轉錄因子的表達量，發現穩定降表達p65之后Slug和Snail的表達量明顯降低，見圖7。

圖7　慢病毒感染MDA-MB-231細胞后，檢測EMT相關轉錄因子的表達量變化Fig 7 pLKO.1-puro shp65 infected MDA-MB-231 cells and the expression of EMT related transcription factors

3　討論

本文分析了TCGA數據庫中22對臨床病例，發現p65的表達量在癌組織中顯著高于正常組織（P＜0.05），預示著p65在乳腺癌的發生發展中的重要作用。p65作為NF-κB的亞單位，由于其具有特殊的反式激活結構域，可以作為轉錄因子調控下游靶基因的轉錄活性，從而在腫瘤的發生、發展中發揮著關鍵性作用，故成為了NF-κB家族研究的焦點。干擾p65的表達能夠抑制NF-κB信號通路的活性，從而抑制腫瘤細胞的增殖及轉移能力［5-7］。

RNAi是近年來發現的一種調控基因表達的生物技術，能夠使基因轉錄產生的mRNA被相應的雙鏈RNA分子結合，從而基因表達被特異的抑制［8］，為疾病的治療提供了新的方案［9］。慢病毒載體容易制備，感染效率高，安全性高，成為實驗室研究中的重要工具［10］。慢病毒干擾載體的制備是將慢病毒載體的特點和RNAi技術的優點結合到一起，使靶基因整合到宿主基因組中，得到靶基因穩定降表達的細胞系。在本文中我們成功構建了穩定干擾p65的慢病毒載體。

用制備好的慢病毒感染MDA-MB-231細胞，發現細胞變得短小，并且增殖能力顯著降低。Transwell實驗檢測其遷移侵襲能力，發現干擾p65之后，細胞的遷移侵襲能力顯著降低，RT-QPCR、Western blot檢測EMT相關轉錄因子以及增殖相關基因的表達量變化，發現Slug、Snail、CCND1和CCNE1的表達量明顯降低。

p65在乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖過程中起到至關重要的作用。在乳腺癌細胞中降表達p65，CyclinD1的表達量下降，細胞的G1/S期轉化過程受到阻礙，乳腺癌細胞的增殖能力受到抑制［11-12］。NF-κB還能夠直接轉錄調節中心體復制相關的酶：Polo樣激酶（polo-like kinase 4，PLK4），PLK4作為p65的靶基因，介導NF-κB調節細胞周期進程［13］。在本文的研究中，我們檢測了細胞周期相關基因的mRNA表達量，發現p65降表達之后CCNE1和CCND1的表達量降低。由于CCNE1和CCND1在細胞周期的進程中促進G1/S期的轉化，結合前人的研究推測p65穩定降表達之后抑制了細胞周期G1/ S期的轉化。

EMT是上皮細胞獲得運動能力的重要機制［14］。此過程中，上皮細胞失去細胞間連接并獲得間質特性。EMT的過程中常伴隨著EMT相關轉錄因子的表達量變化，比如Snail、Slug、Twist1、ZEB2、ZEB1等，他們能夠直接或者間接抑制E-cad的表達［15］。多種基因及信號分子參與NF-κB調節乳腺癌細胞轉移的過程。激活NF-κB信號通路，p65入核增多，能夠轉錄促進Twist1的表達，促進乳腺癌細胞的轉移［3］。同時NF-κB還能夠促進基質金屬蛋白酶（MMP-9）的表達，從而影響乳腺癌的轉移能力［16］。NF-κB能夠誘導COP9信號復合體（CSN）的形成，CSN能夠抑制Snail的泛素化降解，NF-κB間接的促進了Snail的表達［17］。在正常乳腺上皮細胞MCF-10A中，過表達p65抑制上皮標志物上皮細胞鈣粘蛋白（E-cad）的表達，誘導間質標志物波形蛋白（VIM）的表達，使MCF-10A向惡性轉化，使細胞的轉移能力增強［18-19］。本文中檢測了EMT相關轉錄因子Snail、Slug、Twist1的表達量變化，發現在降表達p65之后，Snail、Slug的表達量明顯降低。關于p65影響EMT轉錄因子表達的具體機制還需進一步研究。

在乳腺癌細胞增殖轉移的過程中涉及多種轉錄因子及信號分子，他們之間的相互作用決定細胞的生物學行為。隨著研究不斷深入，p65的很多新功能以及與上下游基因的關系也將逐漸被揭示，可為乳腺癌診斷、治療提供新的分子標志。

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（2016-04-13收稿）

Construction of p65 shRNA knockdown vector and its effect on breast cancer cell MDA-MB-231

HUANG Huan-jing
（Cancer Institute and Hospital，Tianjin Medical University，National Clinical Research Center of Cancer，Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy，Key Laboratory of Breast Cancer Prevention and Therany，Tianjin Medical University，Ministry of Education，Tianjin 300060，China）

Objective：To construct p65-silenced breast cancer cells by RNA interference technology and lentiviral vector，and to study the influence on proliferation and metastasis of breast cancer cell MDA-MB-231.M ethods：Short hairpin RNA（shRNA）was designed and sub-cloned into PLKO.1-puro to construct lentiviral vector.MDA-MB-231 cells were infected，and the expression of p65 was detected by Western blot and RT-QPCR.The effect of p65 on metastasis was detected by transwell assay，and the proliferation ability was measured by cell counting experiment.The expression of proliferation and metastasis related genes were detected by RT-QPCR，Western blot.Results：The PLKO.1-shp65 was successfully constructed，and was stably expressed in MDA-MB-231 cells and could interfere with the expression of human p65 effectively.preliminary function study showed that p65 knockdown inhibited MDA-MB-231 cell proliferation and metastasis. The expression of proliferation and metastases related genes like Snail，Slug，CCNE1 and CCND1 were decreased significantly.

Conclusion：p65-silenced may reduce the proliferation and metastasis ability of MDA-MB-231 cells.

breast cancer；p65；proliferation；metastasis

R737.9

A

1006-8147（2016）05-0386-05

黃環靜（1989-），女，碩士在讀，研究方向：乳腺癌分子診斷與轉移機制，E-m ail：huanjing1989929@126.com。