β片層阻斷肽H102對(duì)雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠腦內(nèi)LPL和PPAR-γ表達(dá)的影響

李靖，付雪斐，孫鳳仙，袁小涌，王超，徐淑梅

（天津醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，天津300070）

論著

β片層阻斷肽H102對(duì)雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠腦內(nèi)LPL和PPAR-γ表達(dá)的影響

李靖，付雪斐，孫鳳仙，袁小涌，王超，徐淑梅

（天津醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，天津300070）

目的：通過(guò)觀察β片層阻斷肽H102對(duì)PS1/APP雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病（AD）模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力以及腦中脂蛋白脂酶（LPL）及PPAR表達(dá)的影響，探究H102對(duì)AD治療作用的可能機(jī)制。方法：將AD模型小鼠隨機(jī)分為模型組和H102治療組，并將同月齡同背景C57BL/6J小鼠設(shè)為正常對(duì)照組，H102治療組小鼠鼻腔給予H102藥液，5 μL/d；模型組及正常組小鼠鼻腔給予輔料溶液，5 μL/d。連續(xù)給藥4周后進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試，檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，并應(yīng)用實(shí)時(shí)定量熒光PCR（real-time PCR）技術(shù)、Western Blot技術(shù)以及免疫組化法，觀察小鼠腦內(nèi)LPL和PPAR-γ表達(dá)的改變。結(jié)果：Real-time PCR技術(shù)、Western Blot技術(shù)以及免疫組化法均顯示，與模型組小鼠相比，H102治療組小鼠腦內(nèi)LPL和PPAR-γ的表達(dá)顯著增加（P＜0.05）。

結(jié)論：β片層阻斷肽H102能夠增加AD小鼠腦內(nèi)LPL的表達(dá)，從而進(jìn)一步促進(jìn)Aβ的細(xì)胞內(nèi)吞與降解，PPAR-γ可能參與其中。

β片層阻斷肽；阿爾茨海默癥；脂蛋白脂酶；PPAR-γ；PS1/APP雙轉(zhuǎn)基因小鼠

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其特征為記憶喪失和其他認(rèn)知惡化等［1］。臨床早期表現(xiàn)主要為患者記憶力的減退和生活自理能力的下降，最終導(dǎo)致發(fā)生進(jìn)行的認(rèn)知功能障礙和缺失、神經(jīng)行為異常，出現(xiàn)精神狀況及生活自理能力的完全喪失［2］。AD典型的病理改變是老年斑（senile plaque，SP）的形成以及神經(jīng)元纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangle，NFT）［3］。AD的病因及發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，有多種假說(shuō)被提出，但尚無(wú)肯定的假說(shuō)來(lái)完整地解釋AD的病因及其發(fā)病機(jī)制。SP沉積中的主要成分是β-淀粉樣肽（β-amyloidpeptide，Aβ），并且越來(lái)越多的證據(jù)表明，Aβ是AD形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素［4-5］。Aβ的神經(jīng)毒性涉及復(fù)雜的分子機(jī)制，主要包括促進(jìn)自由基的形成，破壞細(xì)胞內(nèi)的Ca2+穩(wěn)態(tài)，降低K+通道的功能以及增強(qiáng)致炎細(xì)胞因子引起炎癥反應(yīng)［6-13］。抑制Aβ的聚集或促進(jìn)Aβ的清除也是治療AD的一個(gè)重要手段。脂蛋白脂酶（LPL）主要表達(dá)在脂肪和肌肉，也高度表達(dá)在腦中，但其具體作用是未知的。然而，考慮到脂蛋白在大腦中的主要部分是高密度脂蛋白，它包含可忽略的或無(wú)三酰基甘油，而且大腦缺乏其重要輔助因子--apoCII，推測(cè)LPL在大腦中具有與催化三酰基甘油水解所不同的功能。在小鼠以及成人大腦的突觸重塑提示LPL具有一個(gè)潛在的新功能，即LPL結(jié)合Aβ，并促進(jìn)了細(xì)胞表面對(duì)Aβ的內(nèi)吞和吸收［14］。H102是由10個(gè)氨基酸組成的β片層阻斷肽，能夠預(yù)防或逆轉(zhuǎn)Aβ的錯(cuò)誤折疊和聚集［6-7，13］，能夠減少AD模型小鼠腦內(nèi)Aβ的含量。然而，H102對(duì)于AD腦內(nèi)LPL基因的表達(dá)是否具有調(diào)控作用，是否通過(guò)LPL調(diào)節(jié)Aβ的內(nèi)化，進(jìn)而使Aβ含量減少、學(xué)習(xí)記憶能力提高尚不清楚。在本研究中我們對(duì)此進(jìn)行了探討。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6月齡PS1/APP雙轉(zhuǎn)基因小鼠30只，同背景同月齡C57BL/6J小鼠15只，重25.5～30.5 g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所（雌雄由該研究所隨機(jī)提供），飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2藥品與試劑β片層阻斷肽H102由上海吉爾生物公司合成。LPL抗體和PPAR-γ抗體購(gòu)自美國(guó)ABCAM公司，即用型SABC免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物公司，Trans Start Top Green qPCR Super Mix試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組與給藥PS1/APP雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠隨機(jī)分為2組：模型組和H102治療組，同背景同月齡C57BL/6J小鼠設(shè)為正常對(duì)照組，每組15只。動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用鼻腔給藥方法，H102治療組用自制給藥器給予33 mg/mL藥液5 μL/d；正常對(duì)照組和模型組鼻腔給予等體積輔料溶液（稱(chēng)取0.5 g殼聚糖及0.1 g BSA溶于100 mL雙蒸水中，搖勻，即為輔料溶液），連續(xù)5周。之后進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試［6］，取腦，一側(cè)腦組織放于-80℃凍存?zhèn)溆茫硪粋?cè)腦組織固定后進(jìn)行包埋切片。

1.2.2免疫組化組織石蠟切片常規(guī)脫蠟，蒸餾水沖洗；3%H2O2室溫避光孵育10 min，蒸餾水浸泡，2 min×3次；加0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液中微波沸騰，沸騰后間隔10 min，再沸騰，取出冷卻至室溫，PBS浸泡，2 min×3次；滴加5%BSA封閉，室溫避光孵育15 min，傾去，勿洗；滴加稀釋好的一抗：LPL（1∶200），PPAR-γ（1∶200），4℃過(guò)夜，PBS沖洗，2 min×3次；滴加生物素標(biāo)記的羊抗鼠通用二抗，室溫孵育20 min，PBS沖洗，3 min×3次；滴加SABC液，避光室溫孵育20 min，PBS沖洗，5 min×3次；DAB顯色劑顯色：EP管中加入1 mL雙蒸水，A、B、C液各滴1滴，混勻，去離子水終止顯色反應(yīng)后充分沖洗；蘇木素復(fù)染，雙蒸水充分沖洗，鹽酸酒精分化，溫水反藍(lán)，梯度酒精常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，于顯微鏡下觀察。陰性對(duì)照用0.01 mol/L PBS溶液代替一抗進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其余步驟同上。

1.2.3 Western Blot根據(jù)組織質(zhì)量加入1∶10（m：v）的蛋白裂解液勻漿，提取蛋白。BCA法測(cè)定各組織的蛋白濃度，并用裂解液將各組織的蛋白濃度調(diào)至等濃度，充分混勻后按4∶1加入5×上樣緩沖液，混勻，煮沸5 min，即可直接上樣。配膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育，曝光顯色。LPL一抗?jié)舛葹?∶800；二抗?jié)舛葹?∶5 000。

1.2.4 Real-time PCR反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件：預(yù)熱變性，95℃，5 min；變性，95℃，30 s；退火，59℃，30 s；延伸，72℃，30 s；共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，72℃延伸8 min。每批實(shí)驗(yàn)均做標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)驗(yàn)中同步進(jìn)行內(nèi)參基因β-actin的定量檢測(cè)，以目的基因與內(nèi)參基因相對(duì)濃度比作為目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2　結(jié)果

2.1 Morris 水迷宮結(jié)果顯示，給予H102治療組的小鼠逃避潛伏期比模型組要短的多，且H102組小鼠入水朝向角與模型組小鼠相比明顯減小，而跨越隱性平臺(tái)次數(shù)增多，證明β片層阻斷肽H102可以明顯改善PS1/APP雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

2.2免疫組化染色

2.2.1 LPL免疫組化染色結(jié)果正常對(duì)照組海馬及大腦皮層著色明顯，LPL有明顯表達(dá)；與正常對(duì)照組相比，模型組著色較淺，LPL表達(dá)降低，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；H102治療組與模型組相比，著色較深，LPL表達(dá)增加，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。H102治療組與正常對(duì)照組相比，無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖1及圖2。

圖1　H102對(duì)PS1/APP雙轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層及海馬LPL表達(dá)的影響（×400）Fig 1 The expression of LPL p rotein in m ouse brain detected byimmunohistochem istry（×400）

圖2　各組小鼠大腦皮層及海馬中LPL的表達(dá)Fig 2 The expression of LPL protein in mouse brain

2.2.2 PPAR-γ免疫組化染色結(jié)果正常對(duì)照組大腦皮層著色明顯，PPAR-γ有明顯表達(dá)；與正常對(duì)照組相比，模型組著色較淺，PPAR-γ表達(dá)降低，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；H102治療組與模型組相比，著色較深，陽(yáng)性細(xì)胞增多，PPAR-γ表達(dá)增加，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。H102治療組與正常對(duì)照組相比，無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖3及圖4。

圖3　H 102對(duì)PS1/APP雙轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層PPAR-γ表達(dá)的影響（×400）Fig 3 The expression of PPAR-γ protein in m ouse brain detected by immunohistochem istry（×400）

圖4　各組小鼠大腦皮層PPAR-γ的表達(dá)Fig 4 The expression of PPAR-γ protein in mouse brain

2.3 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果取小鼠海馬及皮層進(jìn)行勻漿提取蛋白質(zhì)。Westrn blot檢測(cè)結(jié)果顯示，LPL能夠出現(xiàn)明顯條帶。與正常對(duì)照組相比較，模型組小鼠蛋白條帶明顯變窄，LPL蛋白的表達(dá)量顯著減少，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，H102治療組的LPL蛋白表達(dá)量明顯升高，蛋白條帶明顯變粗，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；H102治療組與正常對(duì)照組相比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖5。

2.4 Real time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 LPL與正常對(duì)照組比較，模型組LPL mRNA水平顯著降低（P＜0.01）；H102治療組LPL mRNA水平比模型組顯著性升高（P＜0.01）。見(jiàn)圖6。

圖5　各組小鼠腦內(nèi)LPL蛋白的表達(dá)Fig 5 The expression of LPL protein in mouse brain by Western blot assay

圖6　各組小鼠腦內(nèi)LPL m RNA的相對(duì)表達(dá)Fig 6 The expression of LPL m RNA detected by real-tim e PCR

2.4.2 PPAR-γ與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠腦內(nèi)PPAR-γ mRNA水平顯著降低（P＜0.01）；H102治療組小鼠腦內(nèi)PPAR-γ mRNA水平比模型組顯著性升高（P＜0.01）；H102治療組與正常對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖7。

圖7　各組小鼠腦內(nèi)PPAR-γ m RNA的相對(duì)表達(dá)Fig7 Theexpression ofPPAR-γmRNA detected by real-tim e PCR

3　討論

Aβ是AD形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素。如果能抑制病理變化的起始階段或使已形成的斑塊溶解，將有助于疾病的根治。以Aβ為靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)的藥物可通過(guò)抑制Aβ聚集，促進(jìn)Aβ降解和清除，從而達(dá)到減少Aβ毒性的作用［15］。前期研究發(fā)現(xiàn)，β片層阻斷肽能夠與Aβ直接作用，從而預(yù)防或逆轉(zhuǎn)Aβ的錯(cuò)誤折疊和聚集［16］。在本研究中，我們應(yīng)用Morris水迷宮法測(cè)量PS1/APP雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶的能力，結(jié)果表明，給予H102治療組的逃避潛伏期比模型組短，證明β片層阻斷肽H102可以明顯改善PS1/APP雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

在前期工作中我們應(yīng)用基因芯片技術(shù)對(duì)PS1/ APP雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠基因表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因表達(dá)的差異，其中就包括LPL。有研究發(fā)現(xiàn)，LPL可以與Aβ結(jié)合，增加Aβ與細(xì)胞的親和力，從而促進(jìn)Aβ的細(xì)胞攝取以及進(jìn)一步的降解。此外，LPL減少可能促進(jìn)軸突病變［17-18］。LPL也可以是AD的保護(hù)因素，在腦內(nèi)可能通過(guò)脂類(lèi)的清除和回收，粘結(jié)功能和其它未識(shí)別的機(jī)制從而具有抗氧化應(yīng)激的作用［19-20］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)LPL在AD模型組小鼠的大腦中表達(dá)減少，影響了Aβ的內(nèi)吞和降解效率，使得Aβ的聚集增加。而H102能夠影響腦內(nèi)LPL的表達(dá)，H102治療組LPLmRNA水平和蛋白質(zhì)水平均較模型組上調(diào)，這提示H102改善PS1/APP雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用可能與通過(guò)增加LPL的表達(dá)，促進(jìn)Aβ的攝取和降解，最終減少腦內(nèi)Aβ的形成和沉積有關(guān)，也證明了LPL的確與AD的病理機(jī)制密切相關(guān)。

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR）是調(diào)節(jié)目標(biāo)基因表達(dá)的核內(nèi)受體轉(zhuǎn)錄因子超家族成員［21］。根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同，PPAR可分為α、β（或δ）和γ 3種類(lèi)型，其中PPAR-γ主要表達(dá)于脂肪組織及免疫系統(tǒng)，其與胰島素抵抗、機(jī)體免疫反應(yīng)和脂肪細(xì)胞分化有不可分割的關(guān)聯(lián)［22］。PPAR-γ通過(guò)與其相應(yīng)的配體結(jié)合達(dá)到激活狀態(tài)，激活后的PPAR-γ能夠進(jìn)一步與視黃醛X受體α（retinoid X receptor α，RXRα）相互作用而形成異二聚體，之后與特異性DNA序列相結(jié)合而活化靶基因，這個(gè)序列被稱(chēng)為PPAR特異性反應(yīng)元件（peroxisome proliferator responsive element，PPRE）。含有PPRE結(jié)構(gòu)的基因中就包括LPL［23］。PPAR-γ通過(guò)其調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)的作用，在脂肪形成、糖脂代謝以及免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用，并且與多種疾病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，例如糖尿病、肥胖、高血壓、癌癥等［24-25］。此外，PPARγ還能影響NFκB、信號(hào)轉(zhuǎn)錄子、激活蛋白-1介導(dǎo)的信號(hào)通路，通過(guò)抑制這些信號(hào)通路途徑的激活從而對(duì)靶基因啟動(dòng)子的激活和轉(zhuǎn)錄起到抑制作用［26-27］。因此，我們通過(guò)Real-time PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)有PPAR-γ的存在，同時(shí)檢測(cè)了給予H102后小鼠腦內(nèi)PPAR-γ表達(dá)的變化，H102治療組小鼠腦內(nèi)PPAR-γ表達(dá)水平較模型組上調(diào)，免疫組化染色結(jié)果與之相符，均與LPL的表達(dá)變化趨勢(shì)相同。這些結(jié)果表明，β片層阻斷肽H102在腦內(nèi)可能通過(guò)影響PPAR-γ的活性從而調(diào)節(jié)LPL基因的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)Aβ的內(nèi)吞和降解。

總之，在此項(xiàng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)β片層阻斷肽H102能夠改善PS1/APP雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其可能通過(guò)PPAR-γ直接調(diào)節(jié)LPL在腦內(nèi)的表達(dá)來(lái)促進(jìn)Aβ的細(xì)胞內(nèi)吞和進(jìn)一步的降解，從而達(dá)到治療效果。我們的發(fā)現(xiàn)說(shuō)明H102不僅僅能夠直接作用于Aβ，使Aβ的聚集減少，而且能夠通過(guò)影響PPARγ-LPL的表達(dá)來(lái)間接促進(jìn)Aβ的降解，其作用途徑不是單一的，而是多靶點(diǎn)、多方式的。本研究也為AD的發(fā)病機(jī)制探索以及β片層阻斷肽H102對(duì)AD治療作用機(jī)制的研究提供了依據(jù)。

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（2016-03-03收稿）

Effects of β-sheet breaker peptide H 102 on LPL and PPAR-γ protein in double transgenic AD m ice

LI Jing，F(xiàn)U Xue-fei，SUN Feng-xian，YUAN Xiao-yong，WANG Chao，XU Shu-mei
（Department of Physiology，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China）

Objective：To observe the effects of H102 on the learning ability and memory and the expression of LPL and PPAR-γ in PS1/ APP transgenic AD mice.M ethods：PS1/APP transgenic AD mice were random ly divided into two groups：model group and H102 treatment group，while C57BL/6J mice were normal group.The treatment group

33 mg/mL liquid for 5 μL/d，while the normal group and model group were given with an equal volume of materials solution for 4 weeks.After that，the spatial learning ability and memory was tested by Morris Water Maze.Immunohistochemical test，Western blot and quantitative real-time PCR were used to test the expression of LPL.The quantitative real-time PCR and immunohistochemical test were also used to examine the expression of PPAR-γ.Results：Immunohistochemical test，Western blot and quantitative real-time PCR indicated the expression of LPL and PPAR-γ in the model group were decreased significantly than the H102 group（P＜0.05）.Conclusion：β-sheet breaker peptide-H102 may work via regulating the expression of LPL so as to promote the degradation of Aβ，and PPAR-γ may be involved in the procedure.Those findings also prove that LPL in the brain may be highly correlated with the pathogenesis of AD.

β-sheet breaker peptide-H102；Alzheimer's disease；LPL；PPAR-γ；PS1/APP transgene mice

R338

A

1006-8147（2016）05-0396-05

李靖（1990-），女，碩士在讀，研究方向：生理學(xué)；通信作者：徐淑梅：E-mail： xushm@tijmu.edu.cn。