補充維生素D對嚴重燙傷小鼠血清炎性因子濃度變化的影響

韓夏，張明諫，李小兵，劉紅杰，王玉亮，劉子健

（1.天津醫科大學一中心臨床學院整形與燒傷外科，天津300192；2.天津市第一中心醫院整形與燒傷外科，天津300192；3.衛生部危重病急救醫學重點實驗室，天津300384）

論著

補充維生素D對嚴重燙傷小鼠血清炎性因子濃度變化的影響

韓夏1，張明諫2，李小兵2，劉紅杰2，王玉亮3，劉子健2

（1.天津醫科大學一中心臨床學院整形與燒傷外科，天津300192；2.天津市第一中心醫院整形與燒傷外科，天津300192；3.衛生部危重病急救醫學重點實驗室，天津300384）

目的：觀察補充維生素D對嚴重燙傷小鼠血清炎性因子濃度變化的影響。方法：（1）隨機將88只小鼠分為實驗組和對照組各40只，空白對照組8只。（2）實驗組小鼠燙傷后即刻給予1，25（OH）2D34 μg/kg+0.6 mL花生油灌胃，每日1次，至處死前；對照組燙傷小鼠0.6 mL花生油灌胃，每日1次，至處死前。（3）于傷后6、12、24、48、96 h各組分別隨機選擇8只小鼠，用ELISA法檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10含量。（4）于傷后96 h取兩組小鼠腸系膜、肝和脾淋巴結組織分別制成勻漿，做48 h細菌培養計算菌落形成單位數量。結果：（1）燙傷后12、24、48、96 h，實驗組和對照組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10濃度分別高于空白對照組水平（P＜0.05）。（2）燙傷后24、48、96 h，實驗組小鼠血清TNF-α和IL-1β濃度分別低于對照組水平（P＜0.05）；燙傷后12、24、48、96 h，實驗組小鼠血清IL-4和IL-10濃度分別高于對照組水平（P＜0.05）。（3）傷后96 h實驗組小鼠腸系膜、肝和脾淋巴結組織菌落形成單位量分別低于對照組（P＜0.05）。結論：嚴重燙傷小鼠傷后補充維生素D能夠降低TNF-α和IL-1β濃度，提高IL-4和IL-10濃度，并減少腸系膜、肝和脾淋巴結組織菌落形成單位數量。

維生素D；燙傷；炎性因子；小鼠

流行病學資料顯示，維生素D缺乏已經成為一種全球性健康問題［1］。中國人群中維生素D缺乏很普遍，北方較南方嚴重［2］。維生素D缺乏程度與疾病的嚴重程度和預后密切相關［3］。維生素D主要來源于膳食攝入，經皮膚合成的維生素D量約占總量的20%。嚴重燒傷后機體超高代謝、皮膚大面積損傷、膳食營養攝入不足等原因，容易引起維生素D缺乏。嚴重燒傷后機體處于應激狀態，免疫細胞釋放大量炎癥介質，如果抑炎因子與促炎因子失衡，機體會產生全身性炎癥反應綜合征［4］。活性維生素D（1，25（OH）2D3）可以抑制CD40L誘導的促炎因子，并能調節免疫細胞功能［5］。本文對比觀察補充維生素D對嚴重燙傷小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-4和IL-10濃度變化的影響，為燒傷臨床應用維生素D減輕燒傷后炎癥反應提供依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物和分組健康清潔級昆明小鼠88只（軍事醫學科學院放射研究所），雌雄各半，鼠齡6周，體質量27～33 g，動物質量合格證號為0005858。按隨機數字表法將小鼠分成3組，實驗組（燙傷后給予維生素D）和對照組（燙傷后不給予維生素D）各40只，空白對照組（不予燙傷，不補充維生素D）8只。各組小鼠單籠清潔級飼養，自由進食常規小鼠飼料。飼養室溫度22～23℃，環境濕度50%，環境照明20Lx。

1.2小鼠燙傷模型的建立實驗組和對照組小鼠腹腔注射4%水合氯醛（40 mg/kg）麻醉，背部用6%硫化鈉脫毛，脫毛區置于100℃水中12 s，造成背部20%體表面積（total body surface area，TBSA）Ⅲ度燙傷［6］。燙傷后立即經腹腔注射乳酸林格氏液（40 mg/kg）復蘇，第2天給予半量。創面涂20%磺胺嘧啶銀霜抗感染，1次/d。

1.3主要試劑和儀器1，25（OH）2D3（Sigma公司，美國），花生油（Spectrum公司，美國），小鼠常規飼料（蘇州大學動物實驗中心），ELISA試劑盒（上海勁馬生物科技有限公司），麥康凱瓊脂培養基（上海勁馬生物科技有限公司）。

1.4藥物干預方法實驗組小鼠燙傷后即刻給予1，25（OH）2D34 μg/kg+0.6 mL花生油灌胃，1次/d，至處死前；對照組小鼠傷后不補充1，25（OH）2D3，給予0.6 mL花生油灌胃，1次/d，至處死前［7］。

1.5小鼠血清的制備和檢測指標分別于燙傷后6、12、24、48、96 h，每個時相點隨機選取實驗組和對照組小鼠各8只，將小鼠斷頭處死取血。用ELISA法檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10含量。

1.6小鼠內臟淋巴組織勻漿的制備和48 h細菌培養檢測于傷后96 h無菌分離實驗組和對照組小鼠的肝、脾及腸系膜淋巴結組織，稱重、剪碎后制成組織勻漿做細菌培養，經37℃孵育48 h，計算每克組織的菌落形成單位數量（CFU/g）［8］。

1.7空白對照組小鼠處理空白對照組小鼠與燙傷后96 h的小鼠同時處死取血，檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10含量，并無菌分離肝、脾及腸系膜淋巴結組織進行細菌培養。

1.8統計學方法用SPSS19.0軟件進行數據的統計和處理。計量資料以±s±s表示，采用單因素方差分析（one-wayANOVA）、q檢驗和兩獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1實驗各組小鼠一般情況實驗組、對照組和空白對照組小鼠體質量分別為（29.6±2.7）g、（28.7±2.9）g、（30.8±2.5）g，3組體質量均數比較差異無統計學意義（P＞0.05）。實驗組和對照組小鼠燙傷后比空白對照組小鼠活動量減少、精神萎靡、反應遲鈍、懶動、豎毛等。

2.2空白對照組小鼠血清炎癥因子濃度和組織細菌培養結果空白對照組小鼠血清TNF-α濃度為（0.18±0.05）ng/mL、IL-1β濃度為（0.19±0.07）ng/mL、血清IL-4濃度為（0.78±0.13）ng/mL、IL-10濃度為（19.85±3.60）ng/mL。空白對照組小鼠肝、脾及腸系膜淋巴結組織勻漿細菌培養均未檢出菌落。

2.3嚴重燙傷小鼠傷后不同時間血清TNF-α和IL-1β濃度的變化燙傷后6、12、24、48 h和96 h，實驗組和對照組小鼠血清TNF-α和IL-1β濃度分別高于空白對照組水平（P＜0.05）。由表1和表2可見，實驗組和對照組小鼠燙傷后24 h血清TNF-α和IL-1β濃度達峰值。燙傷后24、48、96 h，實驗組小鼠血清TNF-α和IL-1β濃度分別顯著低于對照組水平（P＜0.05）。

表1　嚴重燙傷小鼠傷后不同時間血清TNF-α含量變化（n=8，±s±s，ng/m L）Tab 1 The concentrations of serum TNF-α in m ice at different times post-scald（n=8，±s±s，ng/m L）

表1　嚴重燙傷小鼠傷后不同時間血清TNF-α含量變化（n=8，±s±s，ng/m L）Tab 1 The concentrations of serum TNF-α in m ice at different times post-scald（n=8，±s±s，ng/m L）

組別6 h 12 h 24 h 48 h 96 h F P實驗組2.04±0.47 3.13±0.55 3.53±0.63 3.32±0.47 3.12±0.51 9.507＜0.05對照組2.16±0.56 3.74±0.66 5.42±0.45 4.89±0.53 4.47±0.56 41.328＜0.05 t 0.464 2.008 6.905 6.269 5.041——P>0.05>0.05<0.05<0.05<0.05——

表2　嚴重燙傷小鼠傷后不同時間血清IL-1β含量變化（n=8，±s±s，ng/m L）Tab 2 The concentrations of serum IL-1β in m ice at different times post-scald（n=8，±s±s，ng/m L）

表2　嚴重燙傷小鼠傷后不同時間血清IL-1β含量變化（n=8，±s±s，ng/m L）Tab 2 The concentrations of serum IL-1β in m ice at different times post-scald（n=8，±s±s，ng/m L）

組別6 h 12 h 24 h 48 h 96 h F P實驗組0.31±0.10 0.31±0.05 0.33±0.07 0.29±0.07 0.21±0.09 2.895＜0.05對照組0.29±0.07 0.32±0.09 0.48±0.12 0.44±0.09 0.36±0.06 6.568＜0.05 t 0.463 0.275 3.054 3.721 3.922——P＞0.05＞0.05＜0.05＜0.05＜0.05——

2.4嚴重燙傷小鼠傷后不同時間血清IL-4和IL-10濃度的變化燙傷后12、24、48 h和96 h，實驗組和對照組小鼠血清IL-4和IL-10濃度分別高于空白對照組水平（P＜0.05）。見表3、表4。

表3　嚴重燙傷小鼠傷后不同時間血清IL-4含量變化（n=8，±s±s，ng/m L）Tab 3 The concentrations of serum IL-4 in m ice at different timespost-scald（n=8，±s±s，ng/m L）

表3　嚴重燙傷小鼠傷后不同時間血清IL-4含量變化（n=8，±s±s，ng/m L）Tab 3 The concentrations of serum IL-4 in m ice at different timespost-scald（n=8，±s±s，ng/m L）

組別6 h 12 h 24 h 48 h 96 h F P實驗組1.05±0.35 2.69±0.41 4.32±0.45 4.85±0.34 5.75±0.18 301.502＜0.05對照組0.92±0.27 2.04±0.34 2.88±0.43 2.92±0.47 3.42±0.15 88.306＜0.05 t 0.832 3.452 6.544 9.410 28.126——P＞0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05——

表4　嚴重燙傷小鼠傷后不同時間血清IL-10含量變化（n=8，±s±s，ng/m L）Tab 4 The concentrations of serum IL-10 in m ice at different tim espost-scald（n=8，±s±s，ng/m L）

表4　嚴重燙傷小鼠傷后不同時間血清IL-10含量變化（n=8，±s±s，ng/m L）Tab 4 The concentrations of serum IL-10 in m ice at different tim espost-scald（n=8，±s±s，ng/m L）

組別6 h 12h 24 h 48 h 96 h F P實驗組20.1±4.2 81.4±6.7 142.5±10.4 195.2±11.6 239.7±11.9 687.336＜0.05對照組20.5±4.0 41.2±5.3 90.2±9.7 138.1±9.6 150.9±9.1 422.085＜0.05 t 0.244 13.310 10.402 10.726 16.766——P＞0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05——

2.5嚴重燙傷小鼠傷后96 h不同臟器淋巴結組織細菌培養結果由表5顯示，燙傷后96 h，同組嚴重燙傷小鼠不同臟器淋巴結菌落形成單位數量比較，腸系膜淋巴結菌落數高于肝和脾淋巴結菌落數（P＜0.05）。實驗組小鼠平均每克腸系膜、肝和脾淋巴結菌落形成單位數量分別低于對照組（P＜0.05）。

表5　嚴重燙傷小鼠傷后96 h腸系膜、肝和脾淋巴結組織菌落形成單位數量（n=8，±s±s，CFU/g）Tab 5 The ranges of colony-form ing units of liver，sp leen and mesenteric lymph nodesofm ice at96 h post-scald（n=8，±s±s，CFU/g）

表5　嚴重燙傷小鼠傷后96 h腸系膜、肝和脾淋巴結組織菌落形成單位數量（n=8，±s±s，CFU/g）Tab 5 The ranges of colony-form ing units of liver，sp leen and mesenteric lymph nodesofm ice at96 h post-scald（n=8，±s±s，CFU/g）

*P＜0.05為同一組內不同臟器淋巴結組織細菌移位量兩兩比較

組別腸系膜肝脾F P實驗組780±28.7 147±15.3 254±18.7*1957.595＜0.05對照組850±32.8 180±17.5 295±28.2*1414.852＜0.05 t 4.543 4.015 3.427——P＜0.05＜0.05＜0.05——

3　討論

活性維生素D的主要形式是1，25（OH）2D3，具有免疫調節作用，能夠抑制T、B淋巴細胞的增殖、促進分化，調節細胞因子的產生［9］。輔助型T細胞（Th）是1，25（OH）2D3的重要靶細胞。Th1細胞主要分泌IL-1β、IL-12和TNF-α等促炎因子，Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10等抑炎因子［10］。1，25（OH）2D3能抑制Th1細胞因子釋放，促進Th2細胞因子釋放，表現出以Th2細胞因子釋放為優勢的免疫偏移現象［11］。

燒傷后TNF-α和IL-1β水平的升高被看作是SIRS過程中細胞因子級聯反應的啟動者和反映病情嚴重程度的指標，在燒傷的病理生理過程中發揮重要的作用［12］。本文結果顯示燙傷后24、48、96 h，實驗組小鼠血清TNF-α和IL-1β濃度分別低于對照組水平（P＜0.05），說明補充維生素D能夠減輕燙傷后小鼠血清促炎因子TNF-α和IL-1β的生成。

全身炎癥反應發生的同時，IL-4、IL-10、IL-13等細胞因子通過下調抗原遞呈活動進而抑制多種炎癥介質的產生和釋放。本文結果顯示，燙傷后12、24、48 h和96 h，實驗組小鼠血清IL-4和IL-10濃度分別高于對照組水平（P＜0.05），說明補充維生素D能夠促進燙傷后小鼠血清抑炎因子IL-4和IL-10的生成。

文獻報道1，25（OH）2D3可誘導免疫細胞及分布在天然屏障部位的黏膜上皮細胞分泌抗菌肽（活性形式為IL-37），具有良好的抗菌活性［13-14］。嚴重燒傷后由于應激反應、中毒和感染等因素影響，引起胃腸道黏膜嚴重的缺血缺氧，加上缺血再灌注損傷等因素，導致腸道機械屏障損壞和腸道菌群失調，促使腸道細菌發生移位，進入體循環和臟器淋巴結，形成腸源性感染。本文對燙傷后96 h小鼠肝、脾和腸系膜淋巴結組織細菌培養結果顯示，燙傷后96 h實驗組小鼠平均每克肝、脾及腸系膜淋巴結菌落形成單位數量明顯低于對照組（P＜0.05），說明補充維生素D可減少嚴重燙傷小鼠腸系膜、肝和脾淋巴結組織菌落形成單位數量。

總之，嚴重燙傷小鼠傷后補充維生素D可以減輕炎癥反應過程中促炎因子的生成，并促進抑炎因子的生成。

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（2016-01-22收稿）

Effect of vitam in D supplementation on the changes of serum inflammatory cytokines in severely scalded m ice

HAN Xia1，ZHANG Ming-jian2，LI Xiao-bing2，LIU Hong-jie2，WANG Yu-liang3，LIU Zi-jian2
（1.Department of Burns and Plastic Surgery，The First Central Clinical College，Tianjin Medical University，Tianjin 300192，China；2.Department of Burns and Plastic Surgery，The First Central Hospital of Tianjin，Tianjin 300192，China；3.The Key Laboratory of Critical Care of Medical Ministry of Health，Tianjin 300384，China）

Objective：To explore the effect of vitamin D supplementation on the changes of serum inflammatory cytokines in severely scalded mice.M ethods：（1）Eighty-eight mice were assigned into 3 groups random ly：treatment group（40），control group（40）and blank group（8）.（2）Mice in treatment group were immediately fed 0.6 mL peanut oil with1，25（OH）2D3（4 μg/kg）once a day post-burn，and mice in control group2D3.（3）The levels of serum TNF-α，IL-1β，IL-4 and IL-10 were determined respectively by ELISA at the time of 6，12，24，48 h and 96 h post-scald.（4）The colony-forming units of liver，spleen and mesenteric lymph nodes of mice in two groups were calculated respectively at 96 h post-scald.Results：（1）The serum TNF-α，IL-1β，IL-4 and IL-10 levels in treatment and control group were significantly higher than those in blank group at the time of 12，24，48 h and 96 h post-scald（P＜0.05）.（2）The serum TNF-α and IL-1β levels in treatment group were lower than those in control group at the time of 24，48 and 96 h post-scald（P＜0.05），and the serum IL-4 and IL-10 levels in treatment group were higher than those in control group at the time of 12，24，48 h and 96 h post-scald（P＜0.05）.（3）The numbers of colony-forming units of liver，spleen and mesenteric lymph nodes of mice in treatment group were lower than those in control group at 96 h post-scald（P＜0.05）.Conclusion：Supplementing vitamin D could reduce the levels of serum TNF-α and IL-1β，and increase the level of serum IL-4 and IL-10 in severely scalded mice.And it could reduce the numbers of colony-forming units of liver，spleen and mesenteric lymph nodes of mice post-scald.

only 0.6 mL peanut oil without 1，25（OH）

vitamin D；scald；inflammatory cytokines；mice

論著

R644

A

1006-8147（2016）05-0406-03

韓夏（1990-），男，碩士在讀，研究方向：外科學（燒傷）；通信作者：張明諫，E-m ail：zhangm ingjian@hotmail.com。