二氫嘧啶脫氫酶基因的T85C和A1627G聯合突變對乳腺癌患者預后的影響

劉曉麗，黃勇，楊麗敏，余峰，谷峰，馬勇杰

（天津醫科大學腫瘤醫院腫瘤研究所腫瘤細胞生物學實驗室，國家腫瘤臨床研究中心，教育部乳腺癌防治重點實驗室，天津300060）

論著

二氫嘧啶脫氫酶基因的T85C和A1627G聯合突變對乳腺癌患者預后的影響

劉曉麗，黃勇，楊麗敏，余峰，谷峰，馬勇杰

（天津醫科大學腫瘤醫院腫瘤研究所腫瘤細胞生物學實驗室，國家腫瘤臨床研究中心，教育部乳腺癌防治重點實驗室，天津300060）

目的：探討二氫嘧啶脫氫酶基因（DPYD）的T85C和A1627G突變對浸潤性乳腺癌患者生存的影響。方法：采用SPSS19.0軟件進行統計學分析，使用臨床資料完整的173例浸潤性乳腺癌患者的石蠟包埋組織標本，檢測并分析了DPYD基因編碼序列的第85位點和第1627位點的核苷酸突變情況，并分析其與患者預后的關系。結果：T85C和A1627G位點聯合突變與患者的淋巴結轉移狀態呈正相關。T85C和A1627G位點單突變對乳腺癌患者預后無影響，而與對照組相比，存在T85C和A1627G位點聯合突變的乳腺癌患者預后較差，差異具有統計學意義。結論：中國乳腺癌患者中，DPYD基因T85C和A1627G聯合突變與患者的淋巴結轉移狀態相關，T85C和A1627G聯合突變的患者預后較差。

乳腺癌；二氫嘧啶脫氫酶基因；突變；預后

乳腺癌是嚴重危害女性生命健康的常見惡性腫瘤之一，全球每年約有120余萬婦女患乳腺癌，約50萬婦女死于乳腺癌，且其發病率呈較快增長趨勢，我國乳腺癌患者發病每年約以3%～4%以上的速度遞增，因此，預防和治療乳腺癌意義重大［1-2］。二氫嘧啶脫氫酶（dihydropyrimidine dehydrogenase，DPD）由二氫嘧啶脫氫酶基因（DPYD）編碼產生。人DPYD基因定位于染色體1p22上，全長約950 kb，包括23個外顯子。研究表明，DPYD基因序列上堿基的突變可能引起DPD結構及活性的改變。迄今為止共發現至少50種DPYD的單核苷酸多態性（single nucleotidepolymorphisms，SNP），其中大部分SNP是在DPD酶活性缺乏的患者中測得的［3-4］。目前的研究表明，DPD是在核酸和5-氟尿嘧啶（5-Fu）代謝通路中起重要作用的酶，與腫瘤的進展、腫瘤患者對以5-Fu為基礎的腫瘤化療的敏感性及毒性有關［5-6］。Gamelin等［7］研究81例結腸癌患者外周血單核細胞DPYD活性，發現其與5-Fu化療的毒性呈負相關。Tershima等［8］報道胃癌組織中DPD活性越低，腫瘤對5-Fu的反應就越敏感［8］。值得注意的是，目前對于DPYD基因突變是否影響乳腺癌患者的生存預后尚無報道，在本研究中，我們首次探討了DPYD基因中T85C和A1627G突變對乳腺癌患者生存預后的影響。

1　資料與方法

1.1病例資料隨機選取2010年在天津醫科大學腫瘤醫院接受外科手術治療的173例浸潤性乳腺癌患者的石蠟包埋標本，患者病例信息完整，均為女性，年齡32～75歲，平均年齡（53.31±10.25）歲，所有患者在手術前均未接受過任何腫瘤相關治療。根據WHO乳腺癌組織分類標準分別記錄患者的臨床病理參數：年齡、腫瘤大小、組織學分級、淋巴結狀態和激素受體狀態等。其中年齡分為≤50歲和＞50歲，腫瘤大小分為≤2 cm和＞2 cm，組織學分級用Elston評分標準進行。本研究經天津醫科大學倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

患者的隨訪起點為確診日期，末次隨訪時間為2015年8月27日，平均隨訪48.2月。患者的生存狀態包括死亡和復發情況。腫瘤的復發主要為局部復發（同側鎖骨上、胸壁復發、內乳淋巴結轉移）、對側新發和遠處轉移（對側鎖骨上、頸部淋巴結，肝、骨、肺、腦等其他遠處器官的轉移）?；颊叩臒o進展生存時間定義為從手術之日起至首次發生腫瘤復發或最后一次隨訪的時間。總生存時間定義為從手術之日起至患者死亡或最后一次隨訪的時間。至隨訪截止日，有22例（12.7%）患者出現了腫瘤的復發或遠處轉移，有13例（7.5%）患者死于乳腺癌，有160例（92.5%）患者健在，無失訪病例。

1.2突變檢測DPYD突變檢測采用DPD基因突變檢測試劑盒（diagnostic kit for DPD mutation，中山大學達安基因股份有限公司），定性檢測乳腺癌石蠟包埋組織的人基因組DNA中的DPYD基因編碼序列的第85位點和第1627位點的單核苷酸多態性。T85C SNP為DPYD基因編碼序列第85位核苷酸由胸腺嘧啶（T）突變為胞嘧啶（C），該突變導致半胱氨酸變為精氨酸；A1627G SNP為DPYD基因編碼序列第1627位核苷酸由腺嘌呤（A）突變為鳥嘌呤（G），該突變導致異亮氨基酸被纈氨酸替代。該試劑盒檢測基因突變的原理是采用毛細管電泳技術取代傳統的聚丙烯酰胺電板電泳，應用ABI公司專利的四色熒光染料標記的雙脫氧核糖核苷酸（ddNTP）為反應底物，通過單引物PCR測序反應，生成的PCR產物則是相差1個堿基的3′末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得4種熒光染料的PCR產物可以在一根毛細管內電泳。由于PCR產物分子量不同，在毛細管電泳中的遷移率也不相同，當其通過毛細管讀數窗口段時，激光檢測器窗口中的電荷耦合元件（CCD）攝影機檢測器就可對熒光分子逐個進行檢測，激發的熒光經光柵分光，以區分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光，并在CCD攝影機上同步成像，分析軟件可自動將不同熒光信息轉換為DNA序列信息，從而達到DNA測序的目的。在突變檢測時，為了進行質量控制，設置野生型陽性對照、突變型陽性對照和空白陰性對照，用于判斷突變檢測的準確性，準確性為100%。

1.3統計學方法所有研究數據采用SPSS19.0統計軟件包進行數據分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義的檢驗標準。各組間臨床病理資料及差異的比較使用χ2檢驗，DPYD基因突變情況與乳腺癌臨床病理參數的相關性分析采用Spearman秩相關檢驗。Kaplan-Meier法（乘積極限法）用于繪制生存曲線，生存檢驗采用Log-rank檢驗，分析DPYD基因突變對乳腺癌患者預后的影響。

2　結果

2.1 T85C單突變與浸潤性乳腺癌臨床病理參數無相關性及對乳腺癌患者的預后無影響Kaplan-Meier生存分析發現，DPYD基因的T85C單突變對患者預后無明顯影響，突變組患者的總生存（P=0.253）和無進展生存（P=0.337）與對照組患者無明顯差別（圖1）。

圖1　T85C單突變和A1627G單突變的總生存和無進展生存曲線分析Fig 1 OS&PFS curve of T85C single mutation and A1627G single mutation

本研究分析了T85C單突變與浸潤性乳腺癌的各項臨床病理參數的相關性，發現T85C位點單突變與包括年齡、組織學分級、腫瘤大小、淋巴結轉移狀態、復發和/或遠處轉移、雌激素受體狀態（ER）、孕激素受體狀態（PR）、人類表皮生長因子受體2狀態（Her2）、細胞核相關抗原（Ki67）在內的病理指標均無相關性（表1）。

表1　DPYD的T85C單突變與浸潤性乳腺癌臨床病理參數的相關性［n（%）］Tab 1 Association of T85C single m utation of DPYD and pathological features of invasive breast cancer［n（%）］

2.2 A1627G單突變與浸潤性乳腺癌臨床病理參數無相關性及對乳腺癌患者的預后無影響Kaplan-Meier生存分析發現DPYD基因的A1627G單突變對病人預后也無明顯影響，突變組患者的總生存（P=0.174）和無進展生存（P=0.868）與對照組患者相比無明顯差別（圖1C、D）；筆者還分析了A1627G單突變與浸潤性乳腺癌患者的各項臨床病理參數的相關性，發現A1627G單突變與患者年齡、組織學分級、腫瘤大小、淋巴結轉移、復發和/或遠處轉移、ER狀態、PR狀態、Her2狀態、Ki67等指標均無相關性（表2）。

表2　DPYD的A1627G單突變與浸潤性乳腺癌臨床病理參數的相關性［n（%）］Tab 2 Association ofA1627G singlemutation ofDPYDand pathological features of invasive breast cancer［n（%）］

2.3 T85C和A1627G聯合突變的乳腺癌患者預后差T85C和A1627G聯合突變的患者與對照組患者相比，預后較差。33.3%（3/9）的T85C和A1627G聯合突變患者在隨訪期間發生了復發或遠處轉移，而11.6%（19/164）的對照組患者在隨訪期間發生了復發或遠處轉移。并且，聯合突變組患者的總生存期（P=0.036）和無進展生存期（P=0.021）均明顯縮短，其平均生存期為52.7月，22.2%（2/9）患者死亡，而對照組的患者平均生存期為59.7月，6.7%（11/ 164）患者死亡（圖2）。

分析T85C和A1627G聯合突變與浸潤性乳腺癌的各臨床病理參數之間的相關性，發現T85C和A1627G聯合突變與淋巴結轉移有相關性，且成正相關（rs=0.176，P=0.026），T85C和A1627G聯合突變的患者中88.9%（8/9）發生了淋巴結轉移，對照組患者中50.6%（77/152）發生了淋巴結轉移，差異具有統計學意義（表3）。

圖2　T85C和A1627G聯合突變的總生存和無進展生存曲線分析Fig 2 OS&PFS curve of combined mutations of T85C and A1627G

表3　DPYD的T85C和A1627G聯合突變與浸潤性乳腺癌臨床病理參數的相關性［n（%）］Tab 3 Association of com bined m utations of T85C with A1627G of DPYD and pathological features of invasive breast cancer［n（%）］

3　討論

人類編碼的DPYD基因的多態性包括序列重復丟失、插入以及SNP，其中SNP是最常見的表現形式。研究報道中出現頻率較高的6種DPYD突變型基因分別為DPYD-2，-3，-4，-5，-9，-12，其中DPYD-5（A1627G）和DPYD-9A（T85C）在中國漢族乳腺癌患者中發生率較高，DPYD-5發生率約為39.8%，DPYD-9A發生率約為20.4%，DPYD-5和DPYD-9A聯合突變的發生率約為9.7%［9］。

盡管已明確DPD缺乏癥的分子基礎為DPYD基因突變，但也有研究表明，不同個體中相同的DPYD突變對DPD酶活性的影響可能不同。如錯義突變DPYD-9A可引起DPD活性降低［10］，應用大腸桿菌表達系統也證實這一突變可導致翻譯產生的DPD酶活性完全缺乏［11］，但是也有研究表明DPYD-9A（T85C）在人群中的發生率高達33.8%，且與DPD活性無關，并報道2例DPYD-9A純合子突變基因型的個體表現為正常的DPD活性。同一作者還報道23例DPD活性缺乏者中僅4例存在DPYD基因突變（17%），因而認為DPD缺乏癥的基因型和表型之間缺乏相關性［12］。有研究表明，DPD活性缺乏和DPD活性正常的人群中均存在T85C、G1601A、A1627G以及G2194A等錯義突變，而這些錯義突變與DPD活性缺乏并不相關［13］。有報道使用PCR技術檢測了142例大陸腫瘤患者中的DPD基因，發現T85C、A1627G、T1896C和G2194A基因位點發生突變，但這些位點的基因突變是否引起DPD活性的降低尚未明確［14］。

DPD在黏液細胞癌和分化較差的腺癌中表達水平較高，且與腫瘤浸潤深度和淋巴結轉移相關［15］。在胃癌組織中DPD表達比正常組織高，多因素分析顯示DPD表達陽性患者的總死亡危險性是陰性者的4.9倍［14］。遺憾的是，迄今為止，DPYD基因與DPD表達水平及其生物活性與乳腺癌臨床表現之間的關系尚無明確結論。其原因是多種多樣的，首先DPYD基因突變與DPD的表達水平的關系不明確，DPD酶缺乏癥可能表現為多種遺傳方式，關于確切的遺傳方式目前存在爭議；其次，DPD酶的表達水平不能完全反映其生物學活性的高低，這為應用DPYD基因及DPD表達水平指導臨床實踐帶來了極大的困難。

本研究首次探索了DPYD基因T85C、A1627G突變而非其生物活性或表達對乳腺癌患者生存的影響。我們發現T85C、A1627G各自單突變均不影響患者生存，而T85C和A1627G位點聯合突變與乳腺癌患者的淋巴結轉移呈正相關，并且患者生存期短，預后差，差異具有統計學意義。

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（2016-01-04收稿）

Effect of combined mutations of T85C and A1627G in dihydropyrim idine dehydrogenase gene on prognosis of patients w ith breast cancer

LIU Xiao-li，HUANG Yong，YANG Li-min，YU Feng，GU Feng，MA Yong-jie
（Department of Tumor Cell Biology，Cancer Institute and Hospital，Tianjin Medical University；National Clinical Research Center for Cancer；Key Laboratory of Breast Cancer Prevention and Therapy，Ministry of Education，Tianjin 300060，China）

Objective：To explore the prognostic effect of two mutations，T85C and A1627G of dihydropyrimidine dehydrogenase（DPYD）gene in invasive breast cancer.Methods：Paraffin-embedded specimens of 173 invasive breast cancer patients were sequenced and the nucleotide mutations at 85 and 1627 locus of DPYD gene coding sequence were detected.SPSS 19.0 software package was used to analysis the relationship between these two mutations and patients′prognosis.Results：T85C combined with A1627G mutations showed a positive association with lymph node metastasis in breast cancer patients.T85C or A1627G single mutation was not correlated with prognosis of breast cancer patients.Patients with both T85C and A1627G mutations showed a worse prognosis compared with other patients.

Conclusion：Combination of T85C with A1627G mutations in DPYD may have a positive association with lymph metastasis in Chinese invasive breast cancer patients.T85C combined with A1627G mutations indicates a worse prognosis.

breast cancer；dihydropyrimidine dehydrogenase gene；mutation；prognosis

R737.9

A

1006-8147（2016）05-0412-05

國家自然科學基金資助項目（81272358）

劉曉麗（1984-），女，醫學檢驗技師，研究方向：惡性腫瘤的發生發展機制；通信作者：馬勇杰，E-m ail：yong jiemagu@aliyun.com。