白藜蘆醇對高糖誘導腎小管上皮細胞凋亡的保護作用及機制

宋碧輝 謝紅萍

(南華大學附屬第一醫院腎內科，湖南 衡陽 421001)

?

白藜蘆醇對高糖誘導腎小管上皮細胞凋亡的保護作用及機制

宋碧輝1謝紅萍

(南華大學附屬第一醫院腎內科，湖南 衡陽 421001)

目的 探討白藜蘆醇抑制高糖誘導人近端腎小管上皮細胞株(HK-2)的凋亡及可能機制。 方法 MTT檢測HK-2細胞活力；Hoechst染色法、caspase-3活性檢測細胞凋亡；DCFH-DA檢測細胞內活性氧水平；Real-time PCR檢測Nrf2 mRNA表達；Western印跡法檢測Nrf2蛋白表達。結果 30 mmol/L葡萄糖能顯著降低HK-2細胞活力，誘導細胞凋亡，上調細胞內活性氧的水平，并下調Nrf2 mRNA和蛋白表達。10 μmol/L白藜蘆醇預處理能部分逆轉高糖的作用。結論 白藜蘆醇對高糖誘導的HK-2凋亡的保護機制可能與抑制活性氧的生成和上調Nrf-2的表達有關。

白藜蘆醇；糖尿病腎病；腎小管上皮細胞；Nrf2

糖尿病腎病(DN)在美國是導致終末期腎臟病(ESRD)的最常見病因，約占整個ESRD人群的40%〔1〕。DN早期表現為腎臟細胞外基質增生，腎小球高濾過和腎小管高灌注。隨著病程的進展，引發腎小球和腎小管細胞進行性丟失，最終導致腎小球硬化和腎小管萎縮，腎間質纖維化。從代償性細胞增生向細胞丟失、萎縮的過渡過程中，凋亡是誘導腎細胞進行性丟失的重要機制之一〔2〕。白藜蘆醇具有顯著降低蛋白尿和腎保護的功能〔3〕，本研究體外觀察白藜蘆醇對高糖誘導人近端腎小管上皮細胞細胞凋亡的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥物、主要試劑及儀器 人近端腎小管上皮細胞株(HK-2)，購自中科院上海實驗細胞中心(來源于美國ATCC細胞庫)。白藜蘆醇(Sigma，V900386)，濃度≥98.0%。低糖DMEM細胞培養基、胎牛血清(Hyclone)，葡萄糖溶液(Sigma，G8644)，MTT(碧云天，ST316)，活性氧(ROS)檢測試劑盒(碧云天，S0033)，Hoechst檢測試劑盒(碧云天， C1017)，Caspase-3活性檢測試劑盒(碧云天，C1115)，Trizol(Invitrogen)，逆轉錄試劑盒(Takara)，sybergreen realtime PCR試劑盒(Takara)，Nrf2引物(上海生工)，β-actin引物(上海生工)，Nrf2一抗(Santa Cruz，sc-722)，β-actin一抗(Santa Cruz，sc-47778)，辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗(Santa Cruz，sc-2491)，辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠二抗(Santa Cruz，sc-2489)，ECL化學發光試劑盒(碧云天， P0018)，恒溫細胞培養箱(Thermo)，熒光倒置顯微鏡(Olympus)，5810R低溫高速離心機(Eppendorf)，AB 7300 realtime PCR儀(ABI)，Western印跡裝置(Bio-Rad)，ChemiDoc XRS+凝膠成像分析系統(Bio-Rad)。

1.2 細胞培養 HK-2接種于含10%胎牛血清的DMEM低糖培養基中，置于37℃、5% CO2的培養箱內培養。每隔2天換培養液1次，待細胞生長至融合后，用 0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對數生長期細胞進行實驗。

1.3 實驗分組及干預方法 對照組：細胞正常培養，不加任何處理；葡萄糖處理組：葡萄糖(30 mmol/L)處理HK-2；白藜蘆醇處理組：預先加10 μmol/L白藜蘆醇孵育1 h后加葡萄糖(30 mmol/L)處理24 h；甘露醇(30 mmol/L)對照組。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 細胞存活率檢測 MTT比色試驗檢測細胞存活率。按實驗分組做不同處理后，在培養板中加入10×MTT 20 μl/孔，繼續培養4 h，棄去培養基，加入200 μl DMSO，37℃孵育30 min，酶聯免疫檢測儀測定OD570。

1.4.2 細胞凋亡檢測 ①采用Hoechst法檢測。除去培養液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入固定液室溫固定10 min。棄固定液，加入0.5 ml Hoechst 33258染色液，染色5 min。棄染色液，PBS洗滌3次。倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。②caspase-3活性檢測。收集細胞，PBS洗滌2次。吸盡上清后，按照每200萬細胞加入100 μl裂解液的比例加入裂解液，冰浴裂解15 min。4℃，12 000 r/min，離心15 min。設置反應體系：檢測緩沖液70 μl，待測樣品20 μl，Ac-DEVD-pNA(2 mmol/L)10 μl。37℃孵育60～120 min。測定A405。用Bradford法檢測待測樣品中的蛋白濃度。計算出一個樣品單位重量蛋白中所含的caspase-3的酶活力單位。

1.4.3 細胞內ROS檢測 采用ROS檢測試劑盒檢測。去除培養液，PBS洗滌2次，加入1 ml稀釋好的DCFH-DA(按1∶1 000用無血清培養液稀釋DCFH-DA，終濃度為10 μmol/L)，37℃細胞培養箱內孵育20 min。用無血清細胞培養液洗滌細胞3遍，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.4 Nrf2 mRNA表達檢測 Trizol抽提細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，引物序列：Nrf2正義鏈：TTCAGCAGCATCCTCTCCACAG，反義鏈：GCATGCTGTTGCTGATACTGG。β-actin 正義鏈：CCACACCTTCTACAATGAGC，反義鏈：GGTCTCAAACATGATCTGGG。熒光定量PCR擴增體系及條件：SYBR(2×)5.0 μl ，正義鏈引物(10 μmol/L)0.2 μl，反義鏈引物(10 μmol/L)0.2 μl，cDNA 2.0 μl ，RNase Free dH2O 2.4 μl。反應條件：預變性95℃ 20 s，(95℃ 5 s，60℃ 31 s)，40個循環。反應結束后用7300 System SDS Software分析數據，統計ΔΔCt值，計算相應RQ值，比較各組 mRNA的表達。

1.4.5 Nrf2 蛋白表達檢測 采用Western印跡檢測。Western IP裂解液提取蛋白。取60 μg樣品經10%SDS-PAGE電泳，用半干轉膜法將凝膠上的蛋白轉印至PVDF膜上。5 %脫脂牛奶封閉1 h。一抗(Nrf2 1∶1 000，β-actin 1∶1 000)4 ℃孵育過夜。二抗(山羊抗兔 1∶5 000，山羊抗小鼠 1∶5 000)室溫孵育1 h。用ECL發光劑顯影，采用ChemiDoc XRS+成像系統進行拍照，Image Lab軟件進行灰度分析。

1.5 統計學方法 采用SPSS13.0統計學分析軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1 高糖和白藜蘆醇對HK-2活力的影響 與對照組相比，葡萄糖(30 mmol/L)處理HK-2 24 h，可顯著抑制細胞活力(97.79%±3.51% vs 57.15%±2.51%，P<0.01)，而30 mmol/L甘露醇對照組對細胞沒有影響(90.01%±2.88%);預先用不同濃度白藜蘆醇處理1 h后，白藜蘆醇(10 μmol/L)能顯著上調葡萄糖(30 mmol/L)誘導細胞活力下降(76.67%±4.97%，P=0.005)。

2.2 白藜蘆醇對高糖誘導HK-2凋亡的影響 與對照組相比，葡萄糖(30 mmol/L)處理HK-2 24 h，caspase-3活性顯著升高(96.89%±3.51% vs 246.02%±14.57%，P<0.01)，Hoechst染色檢測凋亡細胞明顯增多，而甘露醇對照組對細胞沒有影響(98.33%±10.92%);預先用白藜蘆醇(10 μmol/L)處理1 h后，可抑制caspase-3活性(150.02%±15.27%，P<0.01)，可減少HK-2細胞凋亡(圖1)。

圖1 白藜蘆醇對高糖誘導HK-2凋亡的影響(Hoechst染色，×200)

2.3 白藜蘆醇對高糖誘導HK-2細胞ROS的影響 與對照組相比，葡萄糖(30 mmol/L)處理HK-2 24 h，ROS的生成顯著增加，而甘露醇對照組對細胞沒有影響，預先用白藜蘆醇(10 μmol/L)處理1 h后，可顯著抑制葡萄糖(30 mmol/L)誘導的ROS生成(圖2)。

圖2 白藜蘆醇對高糖誘導HK-2 ROS生成的影響(×200)

2.4 白藜蘆醇對高糖誘導HK-2細胞Nrf2 mRNA和蛋白表達的影響 與對照組相比，葡萄糖(30 mmol/L)處理HK-2 24 h，Nrf2 mRNA表達顯著降低(1.11±0.14 vs 0.46±0.057，P<0.01)，而甘露醇對照組對細胞沒有影響(1.13±0.16);預先用白藜蘆醇(10 μmol/L)處理1 h后，可顯著上調葡萄糖(30 mmol/L)抑制的Nrf2 mRNA水平(0.80±0.051，P<0.01)。Nrf2蛋白表達結果與mRNA一致，對照組1.01±0.10，葡萄糖處理組0.53±0.08,白藜蘆醇處理組0.82±0.09,甘露醇對照組1.13±0.11(圖3)。

1～4：對照組、葡萄糖處理組、白藜蘆醇處理組、甘露醇對照組圖3 白藜蘆醇對高糖處理HK-2 Nrf2蛋白表達的影響(Western印跡)

3 討 論

高血糖是公認的在DN中起關鍵作用的因子，本實驗發現高糖刺激HK-2 24 h后，Hoechst染色發現凋亡細胞增加，caspase-3活性增加，證明高糖對腎小管上皮細胞的損傷。在高糖作用下，ROS產生過多，氧化應激損傷增強。ROS對腎小球和腎小管的多種細胞均有影響：①高糖可能以ROS為第二信使，上調纖溶酶原激活物抑制物(PAI)-1的表達，促進系膜基質和膠原堆積〔4〕。②ROS通過激活AngⅡ-轉化生長因子(TGF)-β1-Smad 信號途徑誘導系膜細胞分泌過量的TGF-β1，促進細胞外基質的沉積，并減少其降解〔5〕。③ROS通過激活蛋白激酶C(PKC)，使核轉錄因子(NF)-κB發生磷酸化，活化后啟動纖維連接蛋白、層黏連蛋白以及一些炎癥因子的轉錄，增加細胞外基質的沉積〔6〕。④ROS在激活PKC、TGF-β1、AngⅡ等信號通路的同時，這些信號反過來也能誘導高糖狀態下的ROS過度生成，這一正反饋的結果使得ROS成為一種信號放大器，導致了DN氧化應激損傷的惡性循環〔7〕。人類Nrf2基因位于2q31， Nrf2有一高度保守的堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)結構。正常的生理狀態下，Nrf2位于胞質中，與其抑制蛋白Keap1相互作用后降解、失活。當受到來源于活性氧或親核劑的信號攻擊后，Nrf2與Keap1解離從而使其泛素化減少并進入胞核，與其他的bzIP蛋白結合成異二聚體后，與抗氧化反應元件ARE靶向結合，使ARE相關的抗氧化酶基因的表達上調，啟動Nrf2下游靶基因包括過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽硫轉移酶(GST)、血紅素加氧酶(HO-1)等表達，發揮保護作用〔8～10〕。在正常的生理狀態下，HO-1的表達與活力較低，但過氧化氫、內毒素、重金屬、紫外輻射、肺損傷、高氧/低氧等應激條件〔11～13〕，均可通過Nrf2啟動HO-1的表達從而發揮抗氧化作用。本研究用高糖處理后，腎小管上皮細胞Nrf2表達下調，而且Nrf2表達降低與腎小管上皮細胞的凋亡增多一致。由此推測Nrf2可能是一種保護性的信號蛋白，在DN誘導的腎小管損傷中發揮了作用，但是其具體的致病機制、表達的調控以及參與調控誘導細胞凋亡的信號，有待進一步探討。白藜蘆醇是一種天然的多酚醇類化合物，廣泛存在于葡萄籽，花生，虎杖等多種植物中，白藜蘆醇對心血管〔14〕、腫瘤〔15〕、風濕性關節炎〔16,17〕等多種疾病有保護作用，并且能夠通過抗氧化應激和炎癥保護糖尿病大鼠的腎臟，具體機制為激活Nrf2-Keap1信號通路〔18〕，體外實驗也證實白藜蘆醇能通過活化Nrf2/ARE信號通路抑制腎臟系膜細胞的增殖〔19〕，白藜蘆醇還可以通過下調谷胱甘肽轉移酶改善早期大鼠腎功能〔20〕。同樣我們的實驗也證實，白藜蘆醇能上調高糖處理后Nrf2的表達，減少ROS的生成，從而減少腎小管上皮細胞的凋亡。但目前白藜蘆醇抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡的分子機制及信號途徑尚未完全闡明，而且對腎臟病模型動物及患者的腎小管上皮細胞凋亡的干預作用也不明確，需進一步探討。

1 Collins AJ,Foley RN,Herzog C,etal.US Renal Data System 2010 Annual Data Report〔J〕.Am J Kidney Dis,2011;57(Suppl 1):A8,e1-526.

2 Hagiwara S,McClelland A,Kantharidis P.MicroRNA in diabetic nephropathy:renin angiotensin,AGE/RAGE,and oxidative stress pathway〔J〕.J Diabetes Res,2013;2013:173783.

3 Kim MY,Lim JH,Youn HH,etal.Resveratrol prevents renal lipotoxcity and inhibits mesangial cell glucotoxcity in a manner dependent on the AMPK-SIRT1-PGC1α axis in db/db mice〔J〕.Diabetologia,2013;56(1):204-17.

4 Lee EA,Seo JY,Jiang Z,etal.Reactive oxygen species mediate high glucose-induced plasminogen activator inhibitor-1 up-regulation in mesangial cells and in diabetic kidney〔J〕.Kidney Int,2005;67(5):1762-71.

5 Zhou TB,Qin YH,Lei FY,etal.Prohibitin is associated with antioxidative protection in hypoxia reoxygenation-induced renal tubular epithelial cell injury〔J〕.Sci Rep,2013;4(3):3123.

6 Yang J,Zeng Z,Wu T,etal.Emodin attenuates high glucose-induced TGF-β1 and fibronectin expression in mesangial cells through inhibition of NF-κB pathway〔J〕.Exp Cell Res,2013;319(20):3182-9.

7 Hsieh TJ,Fustier P,Wei CC,etal.Reactive oxygen species blockade and action of insulin on expression of angiotensinogen gene in proximal tubular cells〔J〕.J Endocrinol,2004;183(3):535-50.

8 Kumar H,Kim IS,More SV,etal.Natural product-derived pharmacological modulators of Nrf2/ARE pathway for chronic diseases〔J〕.Nat Prod Rep,2014;31(1):109-39.

9 Zhuang C,Miao Z,Sheng C,etal.Updated research and applications of small molecule inhibitors of Keap1-Nrf2 protein-protein interaction:a review〔J〕.Curr Med Chem,2014;21(16):186-90.

10 Chartoumpekis DV,Kensler TW.New player on an old field,the keap1/Nrf2 pathway as a target for treatment of type 2 diabetes and metabolic syndrome〔J〕.Curr Diabetes Rev,2013;9(2):137-45.

11 Na HK,Surh YJ.Oncogenic potential of Nrf2 and its principal target protein heme oxygenase-1〔J〕.Free Radic Biol Med,2014;67C:353-65.

12 Joo Choi R,Cheng MS,Shik Kim Y.Desoxyrhapontigenin up-regulates Nrf2-mediated heme oxygenase-1 expression in macrophages and inflammatory lung injury〔J〕.Redox Biol,2014;2:504-12.

13 Huang XS,Chen HP,Yu HH,etal.Nrf2-dependent upregulation of antioxidative enzymes:a novel pathway for hypoxic preconditioning-mediated delayed cardioprotection〔J〕.Mol Cell Biochem,2014;385(1-2):33-41.

14 Gu XS,Wang ZB,Ye Z,etal.Resveratrol,an activator of SIRT1,upregulates AMPK and improves cardiac function in heart failure〔J〕.Genet Mol Res,2014;13(1):323-35.

15 Zhou C,Ding J,Wu Y.Resveratrol induces apoptosis of bladder cancer cells via miR 21 regulation of the Akt/Bcl 2 signaling pathway〔J〕.Mol Med Rep,2014;9(4):1467-73.

16 Glehr M,Breisach M,Walzer S,etal.The influence of resveratrol on the synovial expression of matrix metalloproteinases and receptor activator of NF-kappaB ligand in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes〔J〕.Z Naturforsch C,2013;68(7-8):336-42.

17 Tian J,Chen JW,Gao JS,etal.Resveratrol inhibits TNF-α-induced IL-1β,MMP-3 production in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes via modulation of PI3kinase/Akt pathway〔J〕.Rheumatol Int,2013;33(7):1829-35.

18 Palsamy P,Subramanian S.Resveratrol protects diabetic kidney by attenuating hyperglycemia-mediated oxidative stress and renal inflammatory cytokines via Nrf2-Keap1 signaling〔J〕.Biochim Biophys Acta,2011;1812(7):719-31.

19 Huang K,Huang J,Xie X,etal.Sirt1 resists advanced glycation end products-induced expressions of fibronectin and TGF-β1 by activating the Nrf2/ARE pathway in glomerular mesangial cells〔J〕.Free Radic Biol Med,2013;65:528-40.

20 Jiang B,Guo L,Li BY,etal.Resveratrol attenuates early diabetic nephropathy by down-regulating glutathione s-transferases Mu in diabetic rats 〔J〕.J Med Food,2013;16(6):481-6.

〔2014-12-09修回〕

(編輯 安冉冉/曹夢園)

1 衡陽市第一人民醫院

謝紅萍(1964-)，女，主任醫師，碩士，碩士生導師，主要從事腎內科疾病診治研究。

宋碧輝(1985-)，女，碩士，主治醫師，主要從事腎內科疾病診治研究。

R285.5

A

1005-9202(2016)19-4686-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.006