絲膠對2型糖尿病大鼠肝臟胰島素受體底物-2表達的影響

邢恩鴻 付文亮 宋成軍 陳志宏

(承德醫學院附屬醫院檢驗科，河北 承德 067000)

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絲膠對2型糖尿病大鼠肝臟胰島素受體底物-2表達的影響

邢恩鴻 付文亮1宋成軍1陳志宏1

(承德醫學院附屬醫院檢驗科，河北 承德 067000)

目的 研究絲膠對2型糖尿病大鼠肝臟胰島素受體底物(IRS)-2表達的影響。方法 36只雄性SD大鼠隨機分為正常對照組、糖尿病模型組、絲膠治療組，每組12只。采用鏈脲佐菌素連續腹腔注射法制作2型糖尿病大鼠模型。待模型成功建立后，絲膠治療組大鼠給予絲膠(2.4 g·kg-1·d-1)灌胃。SP免疫組織化學染色、免疫印跡法和RT-PCR檢測大鼠肝臟組織IRS-2的表達。結果 絲膠可明顯提高糖尿病模型大鼠肝臟組織IRS-2陽性細胞數、IRS-2蛋白和mRNA的表達(P<0.01)。結論 絲膠可通過上調糖尿病大鼠肝臟IRS-2的表達，影響胰島素的信號轉導和改善胰島素抵抗，起到降低血糖的作用。

絲膠；2型糖尿病；肝臟；胰島素受體底物-2；胰島素抵抗

胰島素受體底物(IRS)是參與胰島素及其他細胞因子信號轉導的能夠被激活的胰島素受體酪氨酸激酶作用的底物，磷酸化后能結合并激活下游效應物，是胰島素信號轉導通路中關鍵的中介分子。目前，已發現IRS家族有4個成員(IRS-1～IRS-4)，在組織分布、亞細胞定位、與胰島素結合以及與含SH2蛋白質的相互作用方面存在差異。其中，IRS-2在肝臟大量表達，具有促進肝臟糖原合成和抑制肝葡萄糖輸出的作用〔1〕。由于糖尿病發病率的升高以及化學合成降糖藥物的毒副作用，探尋能夠有效降低血糖并能控制其并發癥的天然物質成為當今研究的熱點。本課題組的前期研究發現，絲膠蛋白(彩色蠶繭水提物)對2型糖尿病(T2DM)大鼠血糖升高和血脂代謝紊亂具有明顯的改善和預防效果，且能有效保護胰島細胞損傷〔2,3〕。但關于絲膠降糖作用的機制目前尚不明確，為此，本研究觀察了絲膠對肝臟IRS-2表達的影響，以期豐富絲膠抗T2DM作用的實驗研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 清潔級雄性SD大鼠36只，合格證號712024，體質量200～250 g，購自河北醫科大學實驗動物學部。絲膠(自制)：由承德醫學院桑蠶研究所提供彩色蠶繭，浸泡、水煎2次后合并濾液，濃縮至所需濃度。鏈脲佐菌素，美國Sigma公司；兔抗IRS-2多克隆抗體，北京博奧森生物技術有限公司；SP免疫組化試劑盒、DAB顯色液，武漢博士德生物工程有限公司；小鼠抗β-actin單克隆抗體，美國Santa Cruz公司；二抗(山羊抗小鼠、抗兔IgG)，美國KPL公司；IRS-2引物，上海生工生物工程有限公司合成；RT-PCR試劑盒、DNA Ladder(600 bp)，北京天根生化科技有限公司。

1.2 實驗動物分組、模型的建立和給藥 36只大鼠隨機分為以下3組：①正常對照組，12只，大鼠常規飼養，不做處理。②糖尿病模型組，12只，建立T2DM大鼠模型后不做處理。建立模型的方法：2%鏈脲佐菌素(25 mg/kg)1次/d連續腹腔注射3 d，注射鏈脲佐菌素后7 d以空腹血糖(FPG)≥16.7 mmol/L作為模型成功建立的標準。③絲膠治療組，12只，按上述方法建立2型糖尿病大鼠模型后按2.4 g/kg的劑量給予絲膠灌胃35 d(1次/d)。

1.3 取材和指標檢測 4%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，經內眥于眶后靜脈叢采血，離心取血清，采用葡萄糖氧化酶法檢測血糖。大鼠取血后處死，取肝臟，部分入Bouins液固定，部分入液氮速凍后移入-80℃冰箱保存。

1.3.1 IRS蛋白表達的檢測 (1)免疫組織化學染色及定量分析：Bouins液固定肝臟，常規石蠟包埋，5 μm厚連續切片。采用免疫組化SP法，一抗1∶70稀釋，DAB顯色，蘇木素復染。以PBS代替一抗作為陰性對照，以細胞膜和(或)細胞質出現棕黃(褐)色顆粒為IRS-2蛋白免疫陽性反應。在10×40倍顯微鏡下每張切片隨機選取組織結構保存較好的肝小葉作為觀察視野，計數免疫陽性細胞數，每組隨機選取6只大鼠的肝臟，每個肝臟選取3張切片，取平均值。(2)免疫印跡法和定量分析：取30 mg冷凍保存肝臟勻漿提取蛋白。二喹林甲酸蛋白試劑盒確定蛋白濃度，8%積層膠和7%分離膠電泳，蛋白上樣量為80 μg，4℃、2 mA/cm2轉膜2h，5%脫脂奶粉封閉過夜，一抗(IRS-2 1∶200，β-actin 1∶1 000)室溫孵育2 h，二抗(1∶5 000)1 h，Super ECL Plus超敏發光液顯影后掃描膠片。采用Quantity One 4.6.2軟件測定灰度值，以IRS-2條帶與β-actin條帶的灰度比值表示待測蛋白的相對水平。

1.3.2 IRS mRNA表達的檢測 采用RT-PCR法。取100 mg冷凍保存肝臟，在液氮中碾磨成粉末后加入Trizol提取總RNA，然后反轉錄成cDNA，反應條件為：42℃孵育3 min；加入反應液Mix，42℃孵育15 min；99℃反應3 min。PCR反應條件：94℃，2 min；94℃，30 s；63℃，30 s；72℃，1 min，第2步起循環。PCR引物序列及擴增條件。IRS-2正義鏈:5′-TGGAGACATTGAGATTGGTTCT-3′；反義鏈:5′-GTAAGAGCGGGGCAAAGAG-3′；退火溫度63℃；循環次數35次；產物大小523 bp。β-actin正義鏈:5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′；反義鏈:5′-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3′退火溫度，57℃；循環次數35次；產物大小452 bp。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后ZF型紫外透射反射分析儀攝片，應用Quantity One 4.6.2軟件測定吸光度，以IRS-2條帶與β-actin條帶吸光度的比值作為待測基因的相對表達水平。

1.4 統計學方法 應用SPSS19.0統計軟件進行單因素方差分析及q檢驗。

2 結 果

2.1 各組大鼠血糖檢測結果 糖尿病模型組大鼠的FPG水平〔(29.45±4.82)mmol/L〕明顯高于正常對照組大鼠〔(10.83±2.03)mmol/L，P<0.01〕；絲膠治療組大鼠的FPG水平明顯低于模型組〔(13.20±4.09)mmol/L，P<0.01〕。見表1。

表1 各組大鼠的肝臟IRS-2陽性細胞數和肝臟IRS-2的表達

與糖尿病模型組比較：1)P<0.01

2.2 大鼠肝臟IRS-2的表達 免疫組化染色結果：IRS-2免疫陽性產物為棕黃色和(或)棕褐色，主要位于肝細胞的細胞膜和細胞質，見圖1；免疫印跡結果、RT-PCR結果見圖2，圖3。與正常對照組大鼠比較，糖尿病模型組大鼠肝臟IRS-2陽性細胞數、肝臟IRS-2蛋白及mRNA的表達明顯降低(P<0.01)；與糖尿病模型組大鼠比較，絲膠治療組大鼠肝臟IRS-2陽性細胞數、肝臟IRS-2蛋白及mRNA的表達明顯升高(P<0.01)。見表1。

圖1 大鼠肝臟組織IRS-2蛋白表達(DAB，×400)

圖2 大鼠肝臟IRS-2蛋白的表達(Western印跡法)

M.Marker；1.正常對照組；2.糖尿病模型組；3.絲膠治療組圖3 大鼠肝臟IRS-2 mRNA的表達(RT-PCR法)

3 討 論

胰島素抵抗(IR)是T2DM的主要發病機制之一，但具體的機制尚不十分明確。研究發現，IRS-2在IR和T2DM的發生過程中都具有重要作用〔4〕。同時敲除IRS-1和IRS-2基因，小鼠不但表現出IR，并且由于胰島β細胞數量的減少，小鼠同時出現了糖尿病的癥狀；而保留IRS-1基因、敲除IRS-2基因，小鼠則因糖尿病很快死亡〔5,6〕。另外，IRS-2還參與了其他信號的交叉反應，如胰島素樣生長因子(IGF)-1、白介素(IL)-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α等，這些信號與葡萄糖轉運蛋白(GLUT)4和蛋白激酶的磷酸化有關〔7,8〕。同時，IRS-2在調節胰島素在肝臟的作用中也發揮重要作用。IRS-2基因敲除的雄性小鼠，8周齡時表現為胰島素抑制肝葡萄糖產生的作用減弱，提示在肝臟存在顯著的IR〔9〕。

本研究發現，T2DM模型大鼠肝臟IRS-2的表達明顯降低。胰島素在體內發揮生理作用的過程包括胰島素與靶細胞胰島素受體的特異性結合、胰島素與受體結合后發生一系列生化反應，使生物信號得以轉導和放大，進而產生生物效應。而IRS-2作為這一過程的重要組分，它的異常表達可導致胰島素信號轉導的異常，進而引發IR。

絲膠約占蠶繭的25%～30%，在繅絲提取絲素時作為廢料丟棄，不僅造成巨大浪費，也造成了環境污染。本研究根據《本草綱目》記載的“蠶繭能煮水治消渴”以及民間蠶繭泡水降血糖的驗方，提取了蠶繭中溶于水的高分子蛋白——絲膠，本研究發現，絲膠能明顯降低T2DM大鼠肝臟IRS-2的表達，提示絲膠可能通過影響肝臟IRS-2的表達，改善胰島素的信號轉導及IR，從而對糖尿病及其并發癥發揮治療作用。絲膠為天然的物質，可避免化學合成降糖藥物帶給人體的毒副作用，因此，有必要深入探討絲膠降血糖的作用機制，為將絲膠開發成為降糖的新藥積累實驗資料。

1 Fritsche L,Weigert C,Haring HU,etal.How insulin receptor substrate proteins regulate the metabolic capacity of the liver-implications for health and disease 〔J〕？Curr Med Chem,2008;15(13):1316-29.

2 付秀美，鐘美蓉，付文亮，等.絲膠對2型糖尿病大鼠血糖和血脂的影響〔J〕.中國老年學雜志，2011;31(1)：103-5.

3 劉 平，劉東慧，付秀美，等.絲膠對糖尿病大鼠胰島細胞神經肽Y表達的影響〔J〕.中國老年學雜志，2014；34(8)：2182-4.

4 Ayaz L,Karakas Celik S,Cayan F.The G1057D polymorphism of insulin receptor substrate-2 associated with gestational diabetes mellitus 〔J〕.Gynecol Endocrinol,2014；30(2):165-8.

5 Withers DJ,Burks DJ,Towery HH,etal.Irs-2 coordinates Igf-1 receptor-mediated beta-cell development and peripheral insulin signaling 〔J〕.Nat Genet,1999；23(1):32-40.

6 Withers DJ,Gutierres JS,Towery H,etal.Disruption of IRS-2 causes type-2 diabetes in mice 〔J〕.Nature,1998;391(6670):900-4.

7 Boden G,Shulman GI.Free fatty acids in obesity and type 2 diabetes:defining their role in the development of insulin resistance and beta-cell dysfunction 〔J〕.Eur J Clin Invest,2002;32(3):14-23.

8 Vazarova B,Weyer C,Hanson K,etal.Circulation interleukin-6 in relation to adiposity,insulin action,and insulin secretion 〔J〕.Obes Res,2001;9(7):414-7.

9 張獻彩.胰島素受體底物-2與胰島素抵抗〔J〕.中國衛生產業，2011;8(12)：184.

〔2015-04-01修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

Effects of sericin on insulin receptor substrate-2 expression in liver of type 2 diabetes mellitus rats

XING En-Hong,FU Wen-Liang,SONG Cheng-Jun,et al.

The Affiliated Hospital of Chengde Medical College,Chengde 067000,Hebei,China

Objective To study the effects of sericin on insulin receptor substrate-2 (IRS-2) in liver of type 2 diabetes mellitus rats.Methods 36 male SD rats were randomly divided into 3 groups (n=12): normal control,diabetes model and sericin treatment groups.The type 2 diabetes model rats were induced by continuous intraperitoneal injection of streptozotocin.After successfully establishing the diabetes animal models,the rats in sericin treatment group were lavaged with sericin (2.4 g·kg-1·d-1).SP immunohistochemical staining,Western blotting and RT-PCR were used to detect the IRS-2 expression in liver.Results Sericin could significantly increase IRS-2 positive cell number,IRS-2 protein and mRNA expression in liver of diabetes model rats (P<0.01).Conclusions Sericin can affect insulin signaling and improve insulin resistance by up regulating IRS-2 expression in liver,thus reduce blood glucose.

Sericin; Type 2 diabetes mellitus; Liver; Insulin receptor substrate-2 (IRS-2); Insulin resistance

國家自然科學基金項目(81441133)；河北省自然科學基金項目(H2013406096)；河北省高校重點發展學科“人體解剖與組織胚胎學”建設項目資助(2013年)

1 承德醫學院人體解剖學教研室

陳志宏(1971-)，女，博士，教授，碩士生導師，主要從事糖尿病及治療研究。

邢恩鴻(1974-)，男，碩士，副主任醫師，主要從事分子生物學和免疫學方面的研究。

R587.1

A

1005-9202(2016)19-4689-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.007