小凹蛋白-1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型中內(nèi)皮型一氧化氮合酶及一氧化氮表達(dá)的影響及白藜蘆醇的作用機(jī)制

張 麗 郭 麗 曲紅玉 李?lèi)?ài)歆 高 山

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

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小凹蛋白-1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型中內(nèi)皮型一氧化氮合酶及一氧化氮表達(dá)的影響及白藜蘆醇的作用機(jī)制

張 麗 郭 麗 曲紅玉 李?lèi)?ài)歆 高 山

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的 探討在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型中小凹蛋白-1的表達(dá)情況及對(duì)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)和一氧化氮(NO)表達(dá)的影響，研究白藜蘆醇的作用機(jī)制。方法 利用同型半胱氨酸誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，采用siRNA法抑制小凹蛋白-1的表達(dá)，采用Western印跡、RT-PCR及化學(xué)發(fā)光法測(cè)定小凹蛋白-1、eNOS和NO的表達(dá)情況；同時(shí)探討白藜蘆醇對(duì)eNOS和NO的表達(dá)影響。結(jié)果 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型中小凹蛋白-1表達(dá)升高，eNOS及NO表達(dá)降低；siRNA技術(shù)沉默小凹蛋白-1后eNOS及NO表達(dá)升高；siRNA技術(shù)沉默小凹蛋白-1后白藜蘆醇對(duì)eNOS及NO的表達(dá)無(wú)影響。結(jié)論 小凹蛋白-1一定程度上對(duì)eNOS及NO的表達(dá)有抑制作用，白藜蘆醇發(fā)揮藥理作用需要通過(guò)小凹蛋白-1介導(dǎo)。

小凹蛋白-1；內(nèi)皮型一氧化氮合酶；一氧化氮；白藜蘆醇

近年來(lái)，對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生機(jī)制提出了多種學(xué)說(shuō)，如炎癥學(xué)說(shuō)和脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)等，炎癥學(xué)說(shuō)認(rèn)為AS的發(fā)生與多種炎癥介質(zhì)作用有關(guān)，如組織因子、細(xì)胞間黏附因子等可以促進(jìn)炎癥的發(fā)生發(fā)展，而內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、Akt及MAPK等具有抗炎作用〔1〕。脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)認(rèn)為AS的發(fā)生與細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量及濃度有關(guān)。另外也有一些研究表明，炎癥因子或介質(zhì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的濃度具有一定的調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定小凹蛋白-1(Cav-1)、eNOS及一氧化氮(NO)的表達(dá)情況進(jìn)一步探討白藜蘆醇(Res)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 臍帶、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清，兔抗人Cav-1多克隆抗體、兔抗人內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)多克隆抗體、TaKaRa RNA PCR試劑盒、硝酸還原酶法試劑盒，Western印跡試劑盒，抗β-肌動(dòng)蛋白(actin)單克隆、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔和抗鼠抗體，硝酸纖維素膜。細(xì)胞培養(yǎng)板，PCR儀，凝膠成像儀。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 無(wú)菌操作取佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院健康孕婦新生兒臍帶10～15 cm，磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡，4℃保存，4 h內(nèi)使用。采用胰蛋白酶灌注法分離臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，接種至含25%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中，隔日換液除去未貼壁細(xì)胞，每3～4 d傳代一次，在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。

1.3 試驗(yàn)分組及處理 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第2代或第3代細(xì)胞用于試驗(yàn)。將人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)按2×104個(gè)/孔的密度接種于6孔板內(nèi)，以含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到70%～80%的融合度開(kāi)始試驗(yàn)，試驗(yàn)前采用無(wú)血清的培養(yǎng)基進(jìn)行同步化并過(guò)夜。培養(yǎng)細(xì)胞分為正常對(duì)照組(NC組，用PBS處理細(xì)胞)，同型半胱氨酸(Hcy)內(nèi)皮細(xì)胞損傷組(Hcy組)，Cav-1 siRNA的內(nèi)皮損傷組(siRNA+Hcy組)，Cav-1沉默后不同濃度Res的內(nèi)皮損傷組(siRNA+Res組)。除NC組外，其余各組均加入1 mmol/L濃度的Hcy進(jìn)行內(nèi)皮損傷模型的構(gòu)建，細(xì)胞培養(yǎng)24 h。

1.4 eNOS和Cav-1 mRNA的測(cè)定 按照RNA PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行各組細(xì)胞中的總RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄cDNA。取2 μl的cDNA進(jìn)行Real-time PCR，反應(yīng)體系為25 μl。eNOS上游引物5′-ACCCTAGAATGGAGAGCAT-3′，下游引物5′-GCCTGCACTGTCTGTGCCA-3′，Cav-1上游引物5′-CCTCTACAAGCTCAACAACATG-3′，下游引物5′-CACATCTTCAGAGTCAATCTGG-3′，內(nèi)參β-actin上游引物5′-AGCGACACAGTGCTGGAC-3′，下游引物5′-ACAAGCAATGATCTTGATGAC-3′。

1.5 一氧化氮(NO)濃度的測(cè)定 按照硝酸還原酶試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定不同組別的細(xì)胞培養(yǎng)液中的NO濃度。

1.6 eNOS和Cav-1蛋白的測(cè)定 根據(jù)Western印跡試劑盒的說(shuō)明，測(cè)定各組eNOS和Cav-1的表達(dá)水平，并采用Image Lab軟件自動(dòng)分析蛋白條帶。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件計(jì)量資料組間比較用單因素方差分析、q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 Hcy致HUVEC損傷的eNOS，Cav-1，NO表達(dá)水平的影響 利用Hcy誘導(dǎo)HUVEC損傷模型后，Hcy損傷組中eNOS及NO表達(dá)明顯下降，而Cav-1表達(dá)明顯升高(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 Hcy致HUVEC損傷的eNOS，Cav-1，NO表達(dá)水平的影響±s)

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.01

2.2 選擇性沉默Cav-1后對(duì)Cav-1表達(dá)的影響 給予siRNA后，Cav-1蛋白表達(dá)顯著降低。RT-PCR測(cè)定Cav-1 mRNA的表達(dá)情況，Hcy損傷組Cav-1 mRNA為0.87±0.16，Hcy+siRNA組為0.14±0.13，提示siRNA成功抑制Cav-1表達(dá)。Cav-1蛋白表達(dá)見(jiàn)圖1。

圖1 Western印跡檢測(cè)Cav-1表達(dá)

2.3 Cav-1沉默后，Res對(duì)NO系統(tǒng)表達(dá)的影響 Cav-1沉默后，eNOS表達(dá)顯著上調(diào)。給予不同濃度Res對(duì)eNOS的表達(dá)未觀察到明顯變化。見(jiàn)圖2，表2。

0：NC組，1：Hcy組，2：siRNA沉默組(10 μmol/L)，3～5：siRNA+Res組(0.1 μmol/L，1 μmol/L，10 μmol/L)圖2 不同濃度Res對(duì)eNOS表達(dá)的影響

表2 Res對(duì)沉默Cav-1表達(dá)后的Hcy致HUVEC損傷的eNOS、NO表達(dá)水平的影響

與NC組比較：1)P<0.01；與Hcy組比較：2)P<0.01

3 討 論

AS是心血管疾病發(fā)生的最常見(jiàn)病理基礎(chǔ)，可以引起冠心病、心絞痛等臨床常見(jiàn)疾病。AS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與多種細(xì)胞因子、蛋白分子及信號(hào)傳到通路有關(guān)。具體發(fā)病機(jī)制目前尚未完全清楚，缺乏有效的預(yù)防藥物。小凹(caveolae)最早于1955年由日本學(xué)家Yamada發(fā)現(xiàn)，是一種特殊的囊泡狀凹陷結(jié)構(gòu)，能夠通過(guò)胞飲、胞吐調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外膽固醇動(dòng)態(tài)平衡〔2〕，小凹家族有多種成員，而其中Cav-1在細(xì)胞內(nèi)的分布最廣，作用最明顯。Maniatis等〔3〕研究證明，Cav-1的氨基酸序列中有可以與游離膽固醇結(jié)合的疏水區(qū)域，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)膽固醇濃度升高時(shí)，Cav-1可與游離膽固醇結(jié)合并將其運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外，再由高密度脂蛋白(HDL)逆轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟，最終在肝臟內(nèi)代謝。因此，Cav-1與AS的病理改變密切相關(guān)。在本研究顯示，Hcy致HUVEC損傷后Cav-1的表達(dá)明顯增高，考慮為HUVEC損傷后細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝失常，導(dǎo)致游離膽固醇濃度升高，從而引起Cav-1升高。

eNOS是一氧化氮合酶中的一種表達(dá)類(lèi)型，能夠在內(nèi)皮細(xì)胞中大量表達(dá)，NO可由eNOS氧化還原機(jī)體內(nèi)氨基酸而形成。正常生理狀況下eNOS及NO在細(xì)胞內(nèi)呈高表達(dá)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞處于病理狀況下時(shí)，eNOS的活性降低，NO的產(chǎn)生及釋放減少，呈低表達(dá)狀態(tài)。蔣承建等〔4〕通過(guò)Hcy損傷大鼠內(nèi)皮細(xì)胞后eNOS及NO的表達(dá)均降低，本實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用Hcy損傷HUVEC后eNOS及NO表達(dá)也明顯降低，與以往研究結(jié)果一致，說(shuō)明eNOS及NO可以延緩AS的發(fā)生發(fā)展。

siRNA技術(shù)是RNA干擾技術(shù)中的一種，主要通過(guò)進(jìn)入宿主細(xì)胞形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物，進(jìn)而與目的基因特異性結(jié)合，使宿主mRNA降解而最終蛋白無(wú)法表達(dá)，達(dá)到基因沉默效果〔5〕。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明siRNA沉默Cav-1技術(shù)成功，而eNOS及NO的表達(dá)升高，說(shuō)明Cav-1對(duì)eNOS及NO的表達(dá)具有抑制作用。前期研究表明〔6〕，在Hcy致HUVEC損傷的模型中，Res可以明顯升高eNOS及NO的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)中，沉默Cav-1后給予Res，eNOS及NO的表達(dá)無(wú)明顯變化，且隨著Res濃度改變，eNOS及NO的表達(dá)仍無(wú)明顯差異，說(shuō)明在沉默Cav-1后，Res對(duì)eNOS及NO的表達(dá)無(wú)調(diào)節(jié)作用。

1 Doi H，Kugiyama K，Oka H，etal.Remnant lipo-proteins induce proatherothrombogenic molecules in endothelial cells through a redox-sensitive mechanism〔J〕.Circulation，2000；102(6)：670-6.

2 Li XA，Everson WV，Smart EJ. Caveolae，lipid rafts，and vascular disease〔J〕.Trends Cardiovasc Med，2005；15(3)：92-6.

3 Maniatis NA，Brovkovych V，Allen SE，et al.Novel mechanism of endothelial nitric oxide synthase activation mediated by caveolae internalization in endothelial cells〔J〕.Circ Res，2006；99(8)：870-7.

4 蔣承建，郭航遠(yuǎn)，唐偉良，等.同型半胱氨酸對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞生成eNOS、p-eNOSs和NO的影響及黃酒的改善作用〔J〕.中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2015；23(5)：475-9.

5 張 麗，李 林，李?lèi)?ài)歆，等.白藜蘆醇對(duì)同型半胱氨酸損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NO、eNOS和小凹蛋白表達(dá)影響〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2014；18(12)：1923-5.

6 Gary DJ,Puri N,Won YY.Polymer-based siRNA delivery：perspectives on the fundamental and phenomenological distinctions from polymer-based DNA delivery〔J〕.Control Release，2007；121(1-2)：64-73.

〔2016-01-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

黑龍江省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No.D201210)

高 山(1964-)，男，碩士，主任醫(yī)師，主要從事循環(huán)系統(tǒng)疾病研究。

張 麗(1973-)，女，碩士生導(dǎo)師，副主任醫(yī)師，主要從事循環(huán)系統(tǒng)疾病研究。

R541.4

A

1005-9202(2016)19-4691-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.008