安腦片對血管性癡呆模型大鼠的保護作用及機制

徐敬軒 欒新平

(新疆醫科大學第二附屬醫院神經外科，新疆 烏魯木齊 830028)

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安腦片對血管性癡呆模型大鼠的保護作用及機制

徐敬軒 欒新平

(新疆醫科大學第二附屬醫院神經外科，新疆 烏魯木齊 830028)

目的 探討安腦片對血管性癡呆(VD)大鼠空間學習記憶障礙的保護作用及機制。方法 健康雄性SD大鼠72只，隨機分為假手術組、模型組、安腦片低、中、高劑量組(50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg)及鹽酸多奈哌齊組(0.5 mg/kg)，每組12只。VD大鼠模型采用雙側頸總動脈結扎法制備，術后給藥30 d。采用Morris水迷宮試驗評價大鼠的空間學習記憶能力，比色法檢測大鼠海馬乙酰膽堿酯酶(AChE)和乙酰膽堿轉移酶(ChAT)活性，Western印跡測定大鼠海馬組織中Bcl-2、Bax及Caspase-3的表達。結果 與假手術組比較，模型組大鼠學習記憶能力顯著降低，大鼠逃避潛伏期及游泳距離明顯延長，穿越平臺區次數及平臺象限游泳距離百分比顯著降低；ChAT活性明顯降低，AChE活性顯著增強；海馬組織中Bcl-2/Bax比值降低，活性Caspase-3表達增加。安腦片中、高劑量均能改善VD大鼠學習記憶能力，縮短大鼠逃避潛伏期及游泳距離，增加大鼠穿越平臺次數及平臺象限游泳距離百分比，增強ChAT活性，降低AChE活性，使海馬組織中Bcl-2/Bax比值增高，活性Caspase-3表達降低。結論 安腦片明顯改善VD大鼠的學習記憶能力，其保護作用可能與其提高大鼠海馬乙酰膽堿水平，減少神經細胞凋亡等有關。

安腦片；血管性癡呆；學習記憶；神經遞質；凋亡

血管性癡呆(VD)是由各種腦血管疾病引起的一種慢性、進行性的獲得性智能損害綜合征〔1〕。近年來中藥在VD的防治上取得了良好的進展〔2～4〕。安腦片由人工牛黃、豬膽汁粉、朱砂、冰片、水牛角濃縮粉等15味藥組成，功能主治為清熱解毒，醒腦安神，豁痰開竅，鎮驚熄風。臨床應用非常廣泛，但主要是以腦系統病變為主的病癥，如中風竅閉證、阿爾茨海默病〔5〕、癲癇、中老年血管性偏頭痛等，但安腦片對VD的藥理作用尚未見報道。本實驗觀察安腦片對VD模型大鼠學習記憶能力、海馬組織中膽堿能神經遞質水平、海馬組織凋亡因子Bcl-2、Bax、Caspase-3表達的影響，探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 儀器、藥品及試劑 ZS001型Morris 水迷宮試驗系統(北京眾實迪創科技發展有限責任公司)，Multiskan MK3型酶聯儀(芬蘭Thermo公司)，Motic Med 6.0 數碼醫學圖像分析系統( 北京航空航天大學)。安腦片(批號150401，哈爾濱蒲公英藥業有限公司，規格：0.5g/片)；鹽酸多奈哌齊片〔批號150106，衛材(中國)藥業有限公司，規格：5 mg/片〕；乙酰膽堿酯酶(AChE)、乙酰膽堿轉移酶(ChAT)檢測試劑盒(批號2015039，南京建成生物技術有限公司)；鼠抗β-actin一抗(美國Santa Cruz公司)；兔抗Bcl-2、Bax、Caspase-3一抗(美國Cell Signaling Technology公司)；抗兔熒光二抗(Rockland公司)；其他試劑均為分析純。

1.2 動物 清潔級雄性SD大鼠，體重250～350 g，由哈爾濱蒲公英藥業有限公司動物實驗中心提供〔動物使用許可證號：SXCK2007-001〕，于哈爾濱蒲公英藥業有限公司實驗室飼養。

1.3 模型的復制 大鼠VD模型采用永久性雙側頸總動脈結扎法制備〔6〕。大鼠術前12 h禁食，自由飲水。術前腹腔注射水合氯醛(300 mg/kg)進行麻醉。麻醉后大鼠仰臥固定于手術臺上，頸前區備皮，碘伏消毒，行頸正中切口長約1.5 cm，鈍性分離皮下組織及肌肉見頸總動脈鞘，小心游離迷走神經，分離出頸總動脈后，近心端及遠心端“4”號線雙重結扎，并中間離斷，確保阻斷動脈血流。術中動作輕柔，避免鉗夾和過分牽拉迷走神經。逐層縫合肌肉及皮膚，切口局部碘伏消毒。術中以紅外線恒溫燈維持大鼠體溫在(37±0.5)℃，并保證大鼠自主呼吸，術后放回籠中常規飼養。假手術組只做切開、縫合等處理，不結扎頸總動脈。

1.4 分組與給藥 72只SD雄性大鼠隨機分為假手術組、模型組、安腦片低、中、高劑量組(分別按50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg給藥)〔7〕、鹽酸多奈哌齊片組(0.5 mg/kg)〔8〕，每組10只。術后灌胃給藥，每天2次，連續給藥30 d。安腦片臨用前用蒸餾水配制成50 mg/ml的混懸液，鹽酸多奈哌齊片用蒸餾水配制成0.5 mg/ml的混懸液，按大鼠體重計算給藥量稀釋為1 ml混懸液給予灌胃。假手術組及模型組每天給予等體積蒸餾水灌胃。

1.5 大鼠學習記憶能力的觀察 采用Morris水迷宮法對大鼠學習和記憶功能進行評估〔9〕。Morris水迷宮準備：實驗室采用燈光照明，迷宮外參照物保持固定，水迷宮內加入溶解黑色食用色素的生活飲用水。將水池等分為四個象限，進行試驗時水溫控制在25℃±2℃。(1)定向航行實驗：選取第一象限正中位置放置一直徑為8 cm的平臺，沒入水下2 cm，將大鼠從第三象限面朝向池壁輕輕放入水中，記錄60 s內找到并爬上平臺所用的時間和路程，若大鼠60 s內尚未找到平臺，則將其引導至平臺停留15 s，逃避潛伏期記錄為60 s。取6 d的平均成績作為測試的成績。(2)空間探索實驗：定向航行實驗結束后撤除平臺，讓大鼠在水池中游60 s來尋找平臺，記錄大鼠60 s內跨越平臺所在象限次數、在平臺所在內象限游動的距離與游泳總距離的比值，取6 d的平均成績作為測試的成績。

1.6 大鼠海馬組織中ChAT、AChE活性測定〔10〕Morris水迷宮實驗結束后，大鼠斷頭取腦，分離海馬組織，放入4℃生理鹽水沖洗殘留血液，稱重。從各組12只海馬組織中隨機選取8只海馬組織加入預冷生理鹽水，超聲波勻漿，制備10%的組織勻漿液，4 000 r/min離心10 min，取上清液備用。按試劑盒說明書中所述ELISIA法測定ChAT、AChE活性。

1.7 Western印跡測定大鼠腦海馬組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達 用細胞裂解液抽提海馬組織總蛋白進行10%SDS-PAGE蛋白電泳，4℃環境中100 V恒壓轉膜1.5 h，5%脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜0.5 h；0.01 mol/L PBS稀釋一抗(1∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜。熒光二抗(1∶5 000稀釋)反應1 h，Motic Med 6.0 數碼醫學圖像分析系統進行圖像分析。以β-actin作為內參。

1.8 統計學方法 采用SPSS16.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1 安腦片對各組大鼠學習記憶的影響 與假手術組比較，模型組大鼠逃避潛伏期及尋找平臺游泳路程明顯延長，撤除平臺后，在60 s內穿越平臺次數及平臺象限游泳路程百分比明顯降低(P<0.05)，說明模型復制成功；與模型組比較，安腦片給藥干預后，安腦片中、高劑量組大鼠的逃避潛伏期及尋找平臺游泳路程均明顯縮短，撤除平臺后，在60 s內穿越平臺次數增多，平臺象限游泳路程百分比明顯升高(均P<0.05)，其效果與鹽酸多奈哌齊組相當，說明安腦片中高劑量對VD模型大鼠的記憶及學習能力具有改善作用。見表1。

表1 安腦片對VD大鼠學習、記憶能力、海馬ChAT、AChE活性的影響

1)與假手術組比較；2)與模型組比較；下表同

2.2 安腦片對各組大鼠海馬組織AChE、ChAT活性的影響 模型組大鼠海馬組織AChE活性對比假手術組明顯升高、而ChAT活性明顯降低(P<0.05)，說明模型組大鼠海馬組織中乙酰膽堿含量減少；與模型組比較，安腦片50 mg/kg藥物干預后AChE活性未見顯著性改變，ChAT明顯降低(P<0.05)。安腦片100 mg/kg、150 mg/kg及鹽酸多奈哌齊組藥物干預后，AChE活性降低，ChAT活性升高(P<0.05)，說明安腦片中、高劑量對VD大鼠海馬組織內乙酰膽堿能神經遞質具有很好的改善作用。見表1。

A.假手術組；B.模型組；C.安腦片中劑量組(100 mg/kg)；D.鹽酸多奈哌齊組；下圖同圖1 大鼠海馬組織中Bcl-2及Bax的表達

2.3 安腦片對各組大鼠海馬組織Bcl-2、Bax及Caspase-3表達的影響 見圖1，圖2，表2。與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織Bcl-2/Bax比值明顯降低、活性Caspase-3表達明顯升高(P<0.05)；安腦片100 mg/kg及鹽酸多奈哌齊組藥物干預后，大鼠海馬組織Bcl-2/Bax比值明顯升高、活性Caspase-3表達明顯降低，與模型組比較具有顯著差異(P<0.05)，說明安腦片可有效降低VD大鼠海馬組織神經細胞的凋亡。

圖2 大鼠海馬組織中Caspase-3的表達

表2 安腦片對VD大鼠海馬組織Bcl-2/Bax及Caspase-3的影響

3 討 論

近年來，VD的發病率隨著人口老齡化、腦血管病等老年性疾病的發病率升高而逐年增高〔11～13〕。VD認知功能受損的形態學基礎是中樞膽堿能神經元的損傷，而膽堿能系統與記憶的形成和貯存密切相關。ChAT與AChE作為乙酰膽堿的合成關鍵酶與分解酶，二者共同調節乙酰膽堿的動態平衡，故可作為估算乙酰膽堿含量的間接標準。有研究證實，VD患者腦組織乙酰膽堿含量減少〔14〕，給予VD大鼠擬膽堿能藥物，可明顯改善VD大鼠的學習記憶功能〔15〕。本研究發現，安腦片藥物干預后，VD大鼠海馬組織內ChAT活性增強，AChE活性明顯降低，可對抗缺血損傷造成的膽堿能神經系統的功能紊亂。

大鼠海馬是與學習記憶關系最為密切的功能區，具有對缺血缺氧很敏感的特點。研究發現VD大鼠海馬CA1區神經元凋亡，說明海馬去大量神經元丟失，是VD發生的可能病理基礎〔16〕。Caspase-3作為細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，在細胞凋亡中起著不可替代的作用，同時，在凋亡基因調控中，Bcl-2及Bax家族起著重要調節作用，Bcl-2 /Bax比值降低則促進凋亡的發生〔17〕。本研究發現，安腦片能降低VD大鼠海馬組織中活性Caspase-3的表達，增加Bcl-2/Bax表達比值，說明安腦片可減少腦缺血引起的神經細胞凋亡，減少神經元的不可逆的缺失，其具體機制可能與其對抗腦缺血時可產生大量自由基，導致脂質過氧化損傷有關。

本研究發現，VD模型大鼠的學習記憶功能下降，安腦片中高劑量組可明顯改善其學習記憶功能，其可能的機制為：①提高海馬組織中神經遞質乙酰膽堿含量，使海馬膽堿能神經系統功能得以恢復；②可能通過調節凋亡相關基因及蛋白的表達，降低海馬組織神經元的凋亡，從而抑制海馬組織神經細胞脫失，改善VD大鼠的認知功能。

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〔2015-12-03修回〕

(編輯 曹夢園)

徐敬軒(1980-)，男，碩士，副主任醫師，主要從事腦血管疾病、顱底腫瘤研究。

R285；R332

A

1005-9202(2016)19-4693-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.009