小鼠腦缺氧后SA1在神經(jīng)細胞中的表達變化

盧 佳 高艷斌 馬 可 陳志明 王治軍

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院眼科，吉林 長春 130033)

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小鼠腦缺氧后SA1在神經(jīng)細胞中的表達變化

盧 佳 高艷斌1馬 可2陳志明3王治軍4

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院眼科，吉林 長春 130033)

目的 檢測小鼠腦缺氧后SA1在神經(jīng)細胞中的轉錄表達變化。方法 將60只小鼠共分為10組，采用手術方式結扎右側頸總動脈，分別于術后3、6、9、12 h、1、3、5、7 d處死。逆轉錄PCR擴增SA1 cDNA，應用RT-PCR檢測其轉錄表達變化。結果 實驗組6 h后SA1表達增高，其表達量隨時間延長增高(P<0.05)。結論 SA1在小鼠腦缺氧后表達增高，說明腦缺氧后細胞染色體黏附發(fā)生改變。

腦缺氧；SA1

在細胞分裂過程中，染色體完整復制后均勻分配到子代細胞中對于遺傳的穩(wěn)定性至關重要，不正確的染色體分離與腫瘤的發(fā)生、發(fā)育異常及老化密切相關〔1,2〕。黏附復合物在染色體分離過程中發(fā)揮關鍵作用〔3〕。盡管染色體間黏附在細胞復制過程中建立，但黏附復合物在G1期即通過SA1和SA2蛋白裝配到染色體上，故SA1蛋白在細胞染色體的正確分離調(diào)控過程中發(fā)揮無法替代的作用〔4,5〕。但關于SA1蛋白在腦缺氧后的表達變化卻未見報道。本研究擬探討SA1表達與小鼠腦缺氧后不同時間段的關系。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型建立 雄性ICR小鼠100只，隨機分為正常對照及腦缺氧組。腦缺氧組分別于術后3、6、9、12 h、1、3、5、7 d(n=6)處死，共計8組，每組6只。處死后取腦組織并迅速置于液氮中速凍，2 min后取出保存于-80℃冰箱中。采用手術結扎右側頸總動脈，用 10%水合氯醛深度麻醉，剪去頸部皮毛，消毒皮膚后沿中線切開皮膚，暴露右側頸總動脈后，結扎后縫合皮膚，置鼠籠(37℃，給氧氣)喂養(yǎng)。正常對照組僅切開頸部皮膚，不做任何處理。

1.2 RNA提取 按照100 mg/ml Trizol試劑將裂解腦組織在室溫孵育10 min；加0.2 ml氯仿后混勻，室溫孵育10 min后，12 000 r/min(4℃)離心10 min。吸取上層水相置于另一EP管中，加等量異丙醇，室溫孵育10～20 min,12 000 r/min(4℃)離心10 min。加1 ml 75%乙醇進行洗滌，12 000 r/min(4℃)離心5 min，棄上清；沉淀室溫下自然干燥；用DEPC水溶解RNA沉淀。采用RT-PCR試劑盒進行逆轉錄PCR。

1.3 RT-PCR檢測 取0.2 ml薄壁PCR管，分組編號。向各管中加入2×qPCR TaqMix 12.5 μl，10 μmol/L各基因正反向引物混合物1 μl。引物序列GAPDH正義TGTGGGCATCAATGGATTTGG，反義ACACCATGTATTCCGGGTCAAT，片段長度116 bp，溫度61℃,SA1正義TGGCAGCGAGCTTGAAGAAA，反義CCACCTCAAATAATGTGACAGGC，片段長度206 bp，溫度62℃。管中不加模板用作陰性對照。各管補加水至25 μl。混勻置于熒光定量PCR儀中。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS19.0軟件行單因素方差分析。

2 結 果

在實驗組中，SA1在顱腦缺氧后表達持續(xù)增高；而對照組腦組織中SA1表達量穩(wěn)定；SA1在小鼠腦缺氧6 h后表達增高，缺氧1 d后達峰值。見表1。

表1 SA1在小鼠缺氧后轉錄表達變化

3 討 論

染色體的正確分離與基因遺傳穩(wěn)定性密切相關，不正確的染色體分離會導致非整倍體細胞的產(chǎn)生，從而引起發(fā)育異常、凋亡發(fā)生甚至腫瘤的產(chǎn)生。SA1蛋白對于細胞分裂過程中染色體的正確分離有重要作用，源于其在有絲分裂G1期可介導黏附復合物裝配于染色體上。黏附復合物由SMC3、SMC1、SCC1及SCC3構成，目前認為上述復合物可形成環(huán)狀拓撲結構，從而將姐妹染色體包繞于其中，盡管SA1及SA2將黏附復合物裝配于染色體的具體機制仍然不清，但SA1在染色體分離調(diào)控過程中的重要作用已被眾多學者所證實〔6,7〕。基因組測序結果證實，SA1基因突變可直接導致發(fā)育性疾病的產(chǎn)生。但其與腦缺氧的關系卻未見有報道，本研究證實，在急性腦缺氧神經(jīng)細胞中，SA1的表達量隨時間改變而發(fā)生改變，提示腦缺氧后神經(jīng)細胞的染色體分離會受到很大影響，而對腦缺氧后染色體分離調(diào)控的研究可能對腦組織修復具有重要意義。

1 Higgins JM.Chromosome segregation:learning to let go〔J〕.Curr Biol,2013;23:R883-5.

2 Murayama Y,Uhlmann F.Chromosome segregation:how to open cohesin without cutting the ring〔J〕?EMBO J,2013;32：614-6.

3 Leman AR,Noguchi E.Linking chromosome duplication and segregation via sister chromatid cohesion〔J〕.Methods Mol Biol,2014;1170:75-98.

4 Tarnowski LJ,Kowalec P,Milewski M,etal.Nuclear import and export signals of human cohesins SA1/STAG1 and SA2/STAG2 expressed in Saccharomyces cerevisiae〔J〕.PloS One,2012;7:e38740.

5 Krasikova A,Barbero JL,Gaginskaya E.Cohesion proteins are present in centromere protein bodies associated with avian lampbrush chromosomes〔J〕.Chrom Res,2005;13:675-85.

6 Liu J,Krantz ID.Cohesin and human disease〔J〕.Ann Rev Genom Human Genet,2008;9：303-20.

7 Musio A,Selicorni A,Focarelli ML,etal.X-linked cornelia de lange syndrome owing to SMC1L1 mutations〔J〕.Nature Genet,2006;38:528-30.

〔2016-05-26修回〕

(編輯 曲 莉)

吉林省科技廳國際科技合作項目(20160414048GH)

1 長春市公安司法鑒定中心 2 吉林大學第一醫(yī)院兒科急診

3 吉林大學基礎醫(yī)學院法醫(yī)系 4 吉林大學第一醫(yī)院小兒外科

王治軍(1979-)，男，主治醫(yī)師，主要從事小兒外科疾病的診治研究。

盧 佳(1979-)，女，主治醫(yī)師，主要從事眼科常見病及眼科病理學研究。

R36

A

1005-9202(2016)19-4711-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.017